Wnt5a對皮膚上皮作用的初步研究.pdf

1、皮膚的上皮細胞直接與外界接觸，通過不斷地更新為機體提供有效的保護屏障。皮膚的表皮由多層細胞構(gòu)成，基底層細胞增殖分裂能力強，不斷地產(chǎn)生子代細胞向上分化，維持表皮的更新。毛囊是由上皮細胞和真皮細胞相互作用形成的皮膚的重要附屬器官之一，依靠周期性生長來實現(xiàn)毛發(fā)的更新。表皮及毛囊的更新受到多種信號途徑的調(diào)節(jié)。Wnt5a為非經(jīng)典途徑的代表，在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。近來有研究表明，Wnt5a能抑制毛囊毛干的生長。但Wnt5a在正常皮膚上皮中的

2、作用尚不清楚，有待我們探討。
　　 在本研究中，我們首先采用細胞計數(shù)和BrdU摻入分析法檢測Wnt5a對表皮細胞增殖的影響，然后采用半定量RT-PCR方法檢測Wnt非經(jīng)典途徑相關(guān)信號分子的改變，最后篩選在Wnt5a處理后有顯著差異的關(guān)鍵分子并檢測其在皮膚上皮中的表達，旨在探討Wnt5a在上皮細胞中的作用及其機制。本實驗研究主要結(jié)果如下:
　　 1.利用HEK-293細胞擴增腺病毒，獲得108PFU/ml的高滴度腺病毒Ad

3、-GFP、Ad-Wnt5a-GFP和Ad-Wnt10b-GFP。
　　 2.采用RT-PCR、細胞免疫熒光方法，表明Ad-Wnt5a-GFP和Ad-Wnt10b-GFP能有效感染JB6細胞。
　　 3.采用細胞計數(shù)、BrdU摻入分析法等方法分別檢測Ad-Wnt5a-GFP與Ad-GFP處理組細胞的增殖，表明Wnt5a能抑制表皮細胞的增殖。
　　 4.采用RT-PCR方法分別檢測Ad-Wnt5a-GFP和Ad-GF

4、P處理組細胞分化指標(K10)的變化，表明Wnt5a能抑制表皮細胞的分化。
　　 5.采用RT-PCR、WB方法分別檢測Ad-GFP、Ad-Wnt5a-GFP、Ad-Wnt10b-GFP和Ad-Wnt5a-GFP+Ad-Wnt10b-GFP處理組細胞中β-catenin mRNA及蛋白的表達，表明Wnt5a處理后抑制了細胞內(nèi)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號的激活。
　　 6.采用RT-PCR方法檢測Ad-Wnt5a-G

5、FP和Ad-GFP處理組非經(jīng)典Wnt途徑相關(guān)信號分子的改變，結(jié)果表明Wnt5a處理JB6細胞后激活了非經(jīng)典Wnt信號通路。
　　 7.采用IHC方法觀察JNK在小鼠皮膚表皮中的表達情況，結(jié)果示JNK在小鼠表皮細胞有中等強度的表達。
　　 8.采用IHC方法檢測了Wnt5a蛋白和JNK蛋白在人頭皮皮膚中表皮中的表達情況。結(jié)果示: Wnt5a蛋白在表皮基底層細胞中表達最強，基底上層表達逐漸減弱，JNK蛋白主要表達于基底上層。

6、
　　 9.采用IHC方法觀察JNK在生后完整毛囊周期中的表達情況。結(jié)果示JNK在毛囊周期中呈動態(tài)表達。
　　 10.采用半定量RT-PCR和WB方法檢測了在小鼠毛囊周期JNKmRNA和蛋白的相對表達情況，與IHC的結(jié)果一致，證明了JNK在毛囊周期中的呈動態(tài)表達。
　　 總之，我們通過一系列實驗證明了Wnt5a在皮膚上皮細胞中的作用。首先我們檢測到Wnt5a抑制表皮細胞的增殖和分化，同時檢測到Wnt5a能激活非經(jīng)