Wnt5a在膀胱移行細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、[研究背景]
　　膀胱癌是一類發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位。2012年全國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率為7.61/10萬，列惡性腫瘤發(fā)病率的第9位。膀胱癌可發(fā)生于任何年齡，甚至于兒童。其發(fā)病率隨年齡增長而增加，高發(fā)年齡階段為50～70歲，并且男性膀胱癌發(fā)病率為女性的4倍。膀胱癌最常見來源于尿路上皮，其發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多種因素調(diào)控的多階段性過程，而且腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移

2、往往是膀胱癌主要的致死原因。因此研究膀胱癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　以往對膀胱癌的研究認(rèn)為局限性的膀胱癌有效生存期為5年，但如果發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移后則有效生存期縮短為3年。如何有效防止腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移從而延長患者的有效生存期成為臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。近來上皮與間葉樣表型轉(zhuǎn)化(EMT)的研究是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)研究熱點(diǎn)。上皮與間葉樣表型轉(zhuǎn)化是一種基本的生理病理現(xiàn)象，其參與胚胎發(fā)育、組織重建和腫瘤轉(zhuǎn)移，上

3、皮細(xì)胞表型的缺失及間質(zhì)特性的獲得是EMT的主要特征之一。與EMT相關(guān)的信號通路有多種，其中Wnt信號通路日益受到重視。Wnt家族是一類含有豐富半胱氨酸的分泌性糖蛋白，包括19種成員，主要通過細(xì)胞表面特異性轉(zhuǎn)錄因子的受體
　　參與細(xì)胞生成、細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞極化以及細(xì)胞遷移等。因此Wnt家族中的許多成員通過Wnt信號傳導(dǎo)系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞的遷移、凋亡、分化、增殖中發(fā)揮著重要作用。Wnt5a是近年來備受關(guān)注的Wnt家族成員之一，它通過參與非經(jīng)

4、典的Wnt信號通路促進(jìn)上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，從而與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。但研究人員在相關(guān)研究中卻得到了一個(gè)貌似矛盾的結(jié)果即Wnt5a在腫瘤組織中的表達(dá)并不一致，即在不同類型的腫瘤中Wnt5a的表達(dá)水平和所發(fā)揮的作用截然不同，即Wnt5a既是抑癌因素又是致癌因素，比如在前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌細(xì)胞、胃癌、胰腺癌等腫瘤中Wnt5a蛋白呈現(xiàn)促癌基因的特性，能夠促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生并且增強(qiáng)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。但在結(jié)直腸癌、白血病及神經(jīng)母細(xì)胞瘤

5、中Wnt5a往往表現(xiàn)出抑癌基因的特性，Wnt5a表達(dá)下調(diào)，并且抑制腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移。其中也有研究提示W(wǎng)nt5a可以被看做是預(yù)后不良的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前Wnt5a在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及與腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，國內(nèi)外尚無相關(guān)系統(tǒng)的研究報(bào)道。
　　[研究目的]
　　1.探討Wnt5a與膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及Wnt5a在膀胱癌轉(zhuǎn)移中的作用和分子機(jī)制。
　　2.尋找膀胱尿路上皮癌轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)。
　　[研

6、究內(nèi)容]
　　1.免疫組織化學(xué)和Real-time PCR檢測Wnt5a在膀胱移行細(xì)胞癌組織及轉(zhuǎn)移樣本中的表達(dá)及臨床相關(guān)性。
　　2.利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染系統(tǒng)建立Wnt5a敲低和過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株，并通過MTT、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測Wnt5a對人膀胱細(xì)胞癌細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力的影響。
　　3.在已建立的Wnt5a敲低和過表達(dá)的穩(wěn)定膀胱癌細(xì)胞株中，免疫印跡和Real-time PCR檢

7、測EMT的標(biāo)志分子，即上皮標(biāo)志物:E-cadherin、N-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物:Snail、Twist，初步探討Wnt5a在膀胱癌轉(zhuǎn)移中的潛在分子機(jī)制。
　　[研究結(jié)果]
　　1.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:在癌旁組織、乳頭狀瘤組織和膀胱尿路上皮癌組織中，Wnt5a的表達(dá)水平依次的升高。Real-time PCR結(jié)果顯示在膀胱癌轉(zhuǎn)移組織中Wnt5a mRNA表達(dá)水平最高，其次是在膀胱癌組織，乳頭狀瘤組織中次之，而在癌旁組

8、織中表達(dá)最低。
　　2.在Wnt5a穩(wěn)定敲低的高轉(zhuǎn)移膀胱癌細(xì)胞株J82中，免疫印跡結(jié)果顯示W(wǎng)nt5a蛋白表達(dá)顯著降低，表明Wnt5a被成功敲低。劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，Wnt5a的敲低導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞株J82的運(yùn)動(dòng)能力降低，Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)nt5a的敲低導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞株的侵襲能力下降，MTT示W(wǎng)nt5a敲低的膀胱癌細(xì)胞株的生長速度明顯延緩。
　　3.在Wnt5a穩(wěn)定高表達(dá)的低轉(zhuǎn)移膀胱癌細(xì)胞株BIU-87中，免疫印

9、跡檢測發(fā)現(xiàn)Wnt5a蛋白的表達(dá)明顯升高，提示穩(wěn)定高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株成功構(gòu)建。劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)nt5a的過表達(dá)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞株的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wnt5a過表達(dá)可導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞株的侵襲能力增強(qiáng)，MTT示W(wǎng)nt5a過表達(dá)膀胱癌細(xì)胞株的的生長速度明顯加快。
　　4.Wnt5a被敲低后， E-cadherin和N-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)增加;Snail和Twist的蛋白和mRNA表達(dá)減少。

10、而Wnt5a過表達(dá)后，E-cadherin和N-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)減少，Snail和Twist的蛋白和mRNA表達(dá)增加，提示W(wǎng)nt5a在膀胱癌細(xì)胞株的EMT過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　[研究結(jié)論]
　　1.Wnt5a的表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和浸潤密切相關(guān)，提示W(wǎng)nt5a可以作為判斷，治療膀胱尿路上皮癌轉(zhuǎn)移的潛在指標(biāo)。
　　2.采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方法成功構(gòu)建Wnt5a穩(wěn)定敲低和穩(wěn)定過表達(dá)的