HSP70對Wnt5a表達(dá)、釋放及其促炎功能的影響.pdf

1、最近研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a是一個高度特異的自分泌及旁分泌的巨噬細(xì)胞來源的效應(yīng)分子，參與了炎癥反應(yīng)過程。Wnt5a釋放到細(xì)胞外，成為一種重要的細(xì)胞因子，介導(dǎo)局部或全身炎癥反應(yīng)，成為目前感染及危重病防治研究的又一個重要分子靶點。熱休克蛋白是熱休克反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，其中的誘導(dǎo)型熱休克蛋白70(HSP70)是最重要的成員，也是誘導(dǎo)產(chǎn)生最多的成員。本研究先觀察Wnt5a在燒傷感染病人血清中含量的改變，并探討誘導(dǎo)型HSP70對Wnt5a表達(dá)、

2、釋放及促炎功能的影響。 首先，本研究觀察了Wnt5a在燒傷病人血清中的改變。結(jié)果如下：(1)燒傷病人血清中Wnt5a的含量顯著高于正常對照組。動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，病情好轉(zhuǎn)血清中Wnt5a含量降低，而病情惡化血清中Wnt5a持續(xù)升高；(2)燒傷病人血清中HSP70含量高于正常對照組，但病人的嚴(yán)重程度與血清中HSP70含量的變化關(guān)系不大。以上結(jié)果表明，Wnt5a參與了燒傷病人炎癥的發(fā)病過程，且檢測Wnt5a可作為炎癥嚴(yán)重程度的診斷指標(biāo)。

3、 炎癥因子主要是由微生物或微生物組份刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，其中LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生與釋放炎癥因子是一個廣泛采用的模型。本研究隨后探討了內(nèi)毒素(LPS)及促炎因子TNF-α對Wnt5α表達(dá)釋放的影響。研究發(fā)現(xiàn)，LPS能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7中Wnt5a表達(dá)上調(diào)及向胞外釋放，同時能誘導(dǎo)促炎因子TNF-α的釋放；用Wnt5a刺激巨噬細(xì)胞，能誘導(dǎo)TNF-α釋放的顯著提高；用TNF-α刺激巨噬細(xì)胞同樣能誘導(dǎo)Wnt5a的表達(dá)釋放上調(diào)

4、。這與文獻(xiàn)報道一致，促炎因子能促進(jìn)Wnt5a的表達(dá)釋放，Wnt5a又能促進(jìn)其他炎癥因子的表達(dá)釋放。因此，本研究進(jìn)一步證明Wnt5a是一個新的炎癥因子，可能參與了燒傷病人炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。 文獻(xiàn)報道，抑炎因子白細(xì)胞介素(IL)-10與活化蛋白C(APC)能抑制Wnt5a的表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)，因此認(rèn)為Wnt5a可以作為炎癥治療的新靶點。熱休克反應(yīng)(HSR)和HSP70在炎癥中的作用也有一些研究。有人認(rèn)為HSP70能抑制某些炎癥因子

5、的釋放和表達(dá)，也有人認(rèn)為，HSP70可能具有促炎功能。作為一個新發(fā)現(xiàn)的炎癥介質(zhì)，Wnt5a在炎癥中功能還知道的很少。HSR和HSP70對Wnt5a的影響也都不清楚。 熱休克蛋白( heat shock proteins，HSPs)是一高度保守的應(yīng)激蛋白家族，廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中。HSP70是熱休克蛋白家族中最重要的成員，其基本功能是參與新生蛋白質(zhì)的折疊、解聚、移位等，故有“分子伴侶”(molecular chapero

6、ne)之稱。長期以來，熱休克蛋白被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，只能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能。為了觀察細(xì)胞內(nèi)的HSP70對Wnt5a的表達(dá)與釋放的影響，在證明Wnt5a能為LPS誘導(dǎo)表達(dá)與釋放，且Wnt5a又能刺激巨噬細(xì)胞釋放其它炎癥因子的基礎(chǔ)上，本研究首次觀察了HSP70對Wnt5a表達(dá)與釋放及其促炎功能的影響。本研究首先構(gòu)建了HSP70的表達(dá)載體。將HSP70的真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入巨噬細(xì)胞得到了高效表達(dá)。利用熱休克預(yù)處理與轉(zhuǎn)基因技術(shù)，分別探討高表達(dá)HS

7、P70的細(xì)胞受LPS或其他炎癥因子刺激時釋放Wnt5a的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理的細(xì)胞相比，溫和的熱休克(42℃)預(yù)處理后的細(xì)胞，在受到LPS與TNF-α刺激時侯，(1)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Wnt5a降低；(2)向細(xì)胞外釋放的Wnt5a減少。受LPS刺激后，轉(zhuǎn)HSP70基因的細(xì)胞與轉(zhuǎn)空載體的細(xì)胞相比，(1)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Wnt5a下降；(2)細(xì)胞向胞外分泌的Wnt5a減少。當(dāng)用TNF-α代替LPS刺激細(xì)胞重復(fù)上述實驗，得到類似結(jié)果。 本研

8、究同樣觀察了細(xì)胞內(nèi)HSP70的上升對Wnt5a促炎功能的影響，發(fā)現(xiàn)不管是溫和熱休克(42℃)還是轉(zhuǎn)HSP70基因，均能顯著抑制Wnt5a誘導(dǎo)的TNF-α釋放。上述結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)上調(diào)既能顯著抑制炎性刺激導(dǎo)致的Wnt5a的表達(dá)與釋放，又能顯著抑制Wnt5a的促炎功能。 近年研究發(fā)現(xiàn)，HSP70能被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，稱為細(xì)胞外HSP70(extracellular HSP70)，而且細(xì)胞外HSP70可能作為免疫

9、系統(tǒng)的“危險信號”，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，參與免疫性疾病的病理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥病人血中HSP70水平明顯升高。為了進(jìn)一步探討細(xì)胞外(包括血清中)HSP70對Wnt5a的影響，本研究采用重組人HSP70刺激巨噬細(xì)胞，然后觀察其對Wnt5a釋放的影響。結(jié)果顯示，HSP70本身對Wnt5a的釋放沒有顯著影響，但能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Wnt5a的釋放。本研究同時檢測了巨噬細(xì)胞IL-10的釋放，表明細(xì)胞外HSP70能顯著促進(jìn)IL

10、-10向細(xì)胞外釋放。隨后本研究觀察了TLR2與TLR4在巨噬細(xì)胞抗炎因子IL-10分泌中的作用，發(fā)現(xiàn)IL-10的分泌依賴于TLR4。 綜上所述，燒傷患者血清中Wnt5a及HSP70水平均明顯升高，并且血清中Wnt5a含量的高低與燒傷膿毒癥的嚴(yán)重程度有關(guān)；LPS與TNF-α能促進(jìn)巨噬細(xì)胞Wnt5a的表達(dá)上調(diào)與分泌上升，Wnt5a反過來又能刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α;熱休克及轉(zhuǎn)基因均能顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)HSP