嘌呤信號(hào)在結(jié)腸癌中的殺傷機(jī)制研究.pdf

1、背景目的：
　　 嘌呤信號(hào)主要由三部分組成:①細(xì)胞外核苷酸，細(xì)胞外微環(huán)境的重要成分;②核苷酸水解酶(如CD39即ENTPD1，二三磷酸核苷酸水解酶-1)，通過將核苷酸水解為核苷來調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答;③核苷酸及衍生物作用的特異性受體。三磷酸腺苷(ATP)不僅在細(xì)胞能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外ATP作為一種新的危險(xiǎn)信號(hào)，通過作用于2型嘌呤受體(P2)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與機(jī)體內(nèi)諸多病理生理過程，如細(xì)胞增殖，

2、分化，凋亡，炎癥反應(yīng)和代謝等。P2受體可以識(shí)別ATP和其他的三磷酸和二磷酸核苷，其家族分為7個(gè)離子通道型P2X受體(P2X1-7)和8個(gè)G蛋白偶聯(lián)P2Y受體(P2Y1，2，4.6，11-14)兩種類型。不同的P2受體對(duì)不同的激動(dòng)劑具有不同的親和力和特異性，可據(jù)此調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。
　　 高濃度的細(xì)胞外ATP通過多種分子機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤活性。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ATP不僅能促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)，而且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒性。在15種P2受體亞

3、型中，有五種直接參與ATP的腫瘤殺傷作用，分別是P2X5，P2X7，P2Y1，P2Y2，P2Y11。然而這些嘌呤受體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷的確切分子機(jī)制尚不明確。
　　 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路處于細(xì)胞功能的調(diào)控中心，在細(xì)胞生長(zhǎng)中處于核心地位。在人類腫瘤中，經(jīng)常發(fā)生mTOR信號(hào)通路的過度激活或突變。mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路活化可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并參與血管生成，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞

4、內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常復(fù)雜，抑制信號(hào)通路中某個(gè)成分，常常破壞關(guān)鍵的負(fù)反饋機(jī)制，以致其他代償通路被激活。因此，充分認(rèn)識(shí)嘌呤信號(hào)的復(fù)雜性（包括負(fù)反饋調(diào)節(jié)回路），以及明確ATP-嘌呤受體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號(hào)通路的下游組成，將有助于明確抑制信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中某特定分子后可能的生物學(xué)后果，為腫瘤的治療尋找新的途徑。
　　 材料方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞培養(yǎng)
　　 2.結(jié)腸癌細(xì)胞MCA38和黑色素瘤細(xì)胞B16/F10體外增殖及活

5、性檢測(cè):CCK-8和原位成像流式細(xì)胞儀分析
　　 3.xCELLigenceRTCAMP儀器實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)
　　 4.克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察MCA38腫瘤細(xì)胞克隆形成情況
　　 5.拮抗劑或激動(dòng)劑（嘌呤受體、Ca2+及選擇性細(xì)胞信號(hào)通路）與MCA38和B16/F10腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞體外增殖/活性，及分析蛋白表達(dá)情況
　　 6.蛋白質(zhì)提取與蛋白印記分析
　　 7.提取RNA，進(jìn)行RT-PCR

6、
　　 8.慢病毒P2X7shRNA構(gòu)建P2X7基因沉默的穩(wěn)定的MCA38和B16/F10腫瘤細(xì)胞株
　　 9.溴化乙錠攝取實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞表面孔洞的形成
　　 10.通過高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)核苷酸水平的變化
　　 11.C57BL/6雄性小鼠腫瘤種植取材
　　 12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 結(jié)果：
　　 1、ATP在體內(nèi)和體外具有抗腫瘤作用
　　 MCA38和B16

7、/F10兩種腫瘤細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞外高濃度ATP的短時(shí)間處理（15-30分鐘），細(xì)胞的活性和增殖被有效抑制，且呈時(shí)間和濃度依賴性。ATP的細(xì)胞毒性對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能有多方面的影響:在體外實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)為抑制細(xì)胞活性、增殖和克隆形成;在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)為抑制C57BL/6野生型小鼠中種植腫瘤的生長(zhǎng)。通過xCELLigenceRTCAMP系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)ATP對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性是直接并且迅速的，并且這種細(xì)胞毒性作用來自于ATP，

8、而非其降解產(chǎn)物ADP或腺苷。即使被極高濃度的ADP或者腺苷(10mM)長(zhǎng)時(shí)間干預(yù)，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)也不受影響。此外，我們還發(fā)現(xiàn)胞外高濃度ATP能顯著誘導(dǎo)作為自噬敏感標(biāo)志的LC3-Ⅱ表達(dá)，這種表達(dá)也呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　 2、ATP對(duì)PI3K/AKT,AMPK和mTOR信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響
　　 我們首先檢測(cè)細(xì)胞外高濃度ATP對(duì)MCA38細(xì)胞和B16/F10細(xì)胞中mTOR、磷酸肌醇-3-激酶和蛋白激酶B(PI3K/AKT)

9、和AMP激酶(AMPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。腫瘤細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞外高濃度ATP處理后，mTOR和PI3K/AKT信號(hào)通路中各分子的磷酸化水平降低，同時(shí)伴隨AMPK通路分子的活化。這種變化呈時(shí)間和濃度依賴性，且與細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)（完全培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基）無關(guān)。
　　 為進(jìn)一步明確ATP誘導(dǎo)的mTOR，PI3K/AKT和AMPK信號(hào)通路的改變情況，我們選用針對(duì)相應(yīng)信號(hào)通路分子的阻斷劑進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。我們選取S6K作為mTOR在活化或失活

10、狀態(tài)中變化的標(biāo)志。首先，岡田酸(OA)是蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的強(qiáng)效抑制劑，它可完全阻斷ATP介導(dǎo)的p-AKT的去磷酸化，而對(duì)傳統(tǒng)意義上的下游靶點(diǎn)分子量為40的富含脯氨酸的AKT底物（PRAS40）并沒有影響。OA也不能逆轉(zhuǎn)ATP對(duì)mTOR信號(hào)通路和對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。PI3K的抑制劑LY294002，幾乎可以完全阻斷AKT-PRAS40-S6K在基礎(chǔ)水平的磷酸化。與理論推斷一致，雷帕霉素抑制S6K磷酸化的程度

11、和ATP相似。表明生理?xiàng)l件下，在腫瘤細(xì)胞中PI3K/AKT-PRAS40是mTOR信號(hào)通路的上游。
　　 其次，復(fù)合物C(CC)是AMPK信號(hào)分子的抑制劑，我們用CC阻斷AMPK的活化可完全逆轉(zhuǎn)ATP引起的S6K磷酸化水平的降低。PRAS40是公認(rèn)的AKT的下游靶點(diǎn)，和p-S6K相似，ATP引起的PRAS40的磷酸化水平的降低可完全被CC逆轉(zhuǎn)，表明AMPK-PRAS40-mTOR是一條新的ATP誘導(dǎo)腫瘤殺傷的信號(hào)通路。
　

12、　 最后，和ATP相似，雷帕霉素能顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中自噬分子LC3-Ⅱ的表達(dá)。而OA或CC能明顯降低LC3Ⅱ在基礎(chǔ)水平或ATP誘導(dǎo)情況下的表達(dá)，單獨(dú)OA或CC干預(yù)都無法逆轉(zhuǎn)ATP引起的細(xì)胞死亡。并且，單獨(dú)用CC干預(yù)腫瘤細(xì)胞可顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(P=0.002)。此外，阻斷PI3K/AKT(LY294002)或者mTOR（雷帕霉素）兩條通路中的任意一條或兩條，都可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但和ATP相比，引起細(xì)胞死亡的程度弱很多。
　　 3、

13、P2X7受體調(diào)控ATP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡
　　 通過RT-PCR分析MCA38細(xì)胞中P2受體家族mRNA的表達(dá)情況，MCA38細(xì)胞表達(dá)P2X3（最少），P2X4-5，P2X6（弱），P2X7，P2Y1，P2Y12-14。BzATP是特異性P2X7受體激動(dòng)劑，隨后，我們用BzATP處理MCA38和B16/F10腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BzATP抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并且誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變，和ATP引起的改變完全一致。而P2X5，P2Y2，P2Y

14、4和P2Y6受體的激動(dòng)劑UTP，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)無影響。此外，非特異性P2受體拮抗劑蘇拉明（Suramin，抑制P2X1-3，P2X5，P2Y1-2，P2Y6和P2Y11-13受體），可阻斷ATP誘導(dǎo)的AMPK信號(hào)通路的激活，但不能逆轉(zhuǎn)ATP對(duì)AKT、PRAS40和S6K磷酸化和對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。同時(shí)，選擇性P2X7受體拮抗劑KN-62，可逆轉(zhuǎn)ATP介導(dǎo)的信號(hào)通路的改變，呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　 4、P2X7基因沉默可

15、保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受ATP的腫瘤殺傷作用
　　 我們應(yīng)用慢病毒P2X7shRNA轉(zhuǎn)染MCA38和B16/F10細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定的P2X7基因沉默的腫瘤細(xì)胞株。在四種P2X7shRNA中，其中一種幾乎完全阻斷了MCA38和B16/F10兩種腫瘤細(xì)胞中P2X7蛋白的表達(dá)。P2X7基因缺陷的腫瘤細(xì)胞幾乎完全逆轉(zhuǎn)了ATP在以下方面對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用:細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，細(xì)胞生長(zhǎng)，克隆形成能力和細(xì)胞自噬。和對(duì)照細(xì)胞相比，P2X7基因沉默細(xì)胞具有

16、更強(qiáng)的增殖和克隆形成潛能。表明P2X7受體，至少是在很大程度上，將高水平的細(xì)胞外ATP信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。
　　 5、細(xì)胞外ATP誘導(dǎo)對(duì)P2X7受體通道功能的影響
　　 首先，通過RT-PCR檢測(cè)P2X7受體兩種剪切異構(gòu)體(splicevariant)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在mRNA水平，MCA38細(xì)胞和B16/F10細(xì)胞都只表達(dá)P2X7(a)。其次，以溴化乙錠攝取實(shí)驗(yàn)評(píng)估P2X7通道功能尤其是細(xì)胞表面孔洞的形成，

17、發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞中，胞外高濃度ATP能顯著刺激對(duì)溴化乙錠的攝取。第三，以HPLC方法測(cè)定胞外高濃度ATP處理腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ATP,ADP和AMP的濃度的變化情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度繼發(fā)性降低，同時(shí)伴隨ADP和AMP水平及AMP/ATP比率的顯著升高，以上發(fā)現(xiàn)和ATP-P2X7誘導(dǎo)AMPK信號(hào)通路激活的結(jié)果一致。第四，接下來通過應(yīng)用拮抗劑研究證實(shí)，P2X7受體激活導(dǎo)致PI3K/AKT和AMPK/mTOR信號(hào)通路的改變，與原始孔洞形成轉(zhuǎn)

18、載蛋白（包括pannexin-或connexin-類型的通道）以及活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）無關(guān)。生胃酮（CBX，pannexin-或connexin-類型的藥理學(xué)抑制劑）和N-乙酰半胱氨酸(NAC，廣譜抗氧化劑)對(duì)ATP誘導(dǎo)的P2X7信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)都無影響。
　　 最后，我們發(fā)現(xiàn)P2X7受體激活可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自噬，特異性藥理學(xué)抑制劑（如Z-VAD-fmk，細(xì)胞凋亡蛋白酶抑制劑，或凋亡特異

19、性抑制劑Necrostatin-1）都不能逆轉(zhuǎn)ATP誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡。
　　 6、Ca2+信號(hào)和ATP-P2X7介導(dǎo)的腫瘤殺傷活性無關(guān)
　　 我們選取了兩種改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的化學(xué)藥物進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。BAPTA-AM和毒胡蘿卜素(TG)，BAPTA-AM是選擇性細(xì)胞通透的鈣離子螯合劑，可降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度;毒胡蘿卜素(TG)，是高效的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶抑制劑，能導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平迅速升高。我們發(fā)現(xiàn)B

20、APTA-AM不能逆轉(zhuǎn)ATP誘導(dǎo)的mTOR信號(hào)通路的抑制和LC3-Ⅱ水平的增加，但可以完全阻斷PI3K/AKT和mTOR通路以及LC-3Ⅱ在基礎(chǔ)水平的激活，對(duì)AMPK信號(hào)通路沒有影響，同時(shí)也可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。TG可激活A(yù)MPK信號(hào)通路，但是對(duì)PI3K/AKT和mTOR通路及細(xì)胞自噬無影響。
　　 結(jié)論：
　　 1、細(xì)胞外高濃度ATP可直接抑制細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬引起腫瘤細(xì)胞死亡，且呈時(shí)間和濃度依賴性;
　　

21、 2、ATP介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通過激活兩條獨(dú)立的信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)，分別是AMPK-PRAS40-mTOR和PI3K/AKT信號(hào)通路;
　　 3、P2X7受體是ATP介導(dǎo)的信號(hào)通路上游調(diào)控的關(guān)鍵分子，ATP-P2X7誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡是通過細(xì)胞內(nèi)核苷酸外流誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死實(shí)現(xiàn)的;
　　 4、生理?xiàng)l件下，一定濃度的Ca2+是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)必需的，與ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性無關(guān)。
　　 總之，我們推斷出高濃度的細(xì)胞外ATP通過