整合素ανβ與ERk-ETS1信號通路在調控結腸癌侵襲轉移中的作用機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 整合素αvβ6對結腸癌細胞侵襲轉移的影響
　　目的：
　　研究整合素αvβ6對MMPs在mRNA和蛋白水平上表達的影響。
　　方法：
　　1.將HT-29或者WiDr細胞系分別分成三組:野生組(wild-type)、干擾β6組(Antisenceβ6)、對照組(control or mock)。將SW480細胞系分成三組:SW480野生型(wild type)

2、、空白質粒對照組(mock transfected)以及β6轉染組(β6 transfected)。通過流式細胞技術以及western blot兩種方法分別進行檢測整合素αvβ6的表達情況，以檢驗我們的干擾效果，為進行后續(xù)實驗做準備。
　　2.利用quantitative Real-time PCR技術，對前述的各組結腸癌細胞中的有關MMPs的表達進行mRNA水平的檢測。
　　3.對相關的MMPs的表達情況采用ELISA方法

3、進行蛋白水平檢測。
　　結果：
　　1.在結腸癌細胞系SW480中，流式細胞技術以及western blot兩種方法均顯示SW480野生型(wild type)、空白質粒對照組(mock transfected)不表達整合素β6，β6轉染組(β6 transfected)中的β6表達明顯升高。另外，在各組細胞中整合素αv亞基表達無明顯差異。
　　2.在結腸癌細胞系HT29與WiDr中，干擾β6表達后，流式細胞技術以及w

4、esternblot兩種方法均顯示:與野生型(wild type)和空白質粒對照組(mocktransfected)相比，β6干擾組(β6 Antisence)β6表達明顯降低。此外，各組細胞的整合素αv亞基表達無明顯差異。
　　3.Real-time PCR結果顯示，在結腸癌細胞系HT29與WiDr中，相比較野生型(wild type)和空白質粒對照組（mock transfected），我們發(fā)現(xiàn)β6干擾組(β6antisens

5、e)中MMP-2、MMP-3以及MMP-9的mRNA表達顯著降低，而其他幾種MMPs，包括MMP-1、MMP-7以及MMP-13，在干擾β6后表達無明顯變化。
　　結論及意義：
　　本部分旨在研究整合素αvβ6對MMPs在mRNA和蛋白水平上表達的影響，首先通過質粒轉染等手段在結腸癌細胞系（包括SW480、HT29以及WiDr）過表達或者干擾整合素中β6的表達，并進一步通過流式細胞技術以及western blot兩種方法分別

6、進行檢驗我們的干擾效果，為進行后續(xù)實驗做準備。接下來通過quantitative Real-time PCR技術和ELISA方法來檢測整合素αvβ6對MMPs在mRNA和蛋白水平上表達的影響。本部分結果顯示，整合素αvβ6可以促進MMP-2、MMP-3以及MMP-9的表達，對整合素αvβ6的理論知識進一步豐富，并為下一步研究整合素αvβ6促進結腸癌侵襲轉移機制的研究打下基礎。
　　第二部分 轉錄因子ETS1介導整合素αvβ6調控M

7、MPs機制研究
　　目的：
　　研究轉錄因子ETS1對αvβ6調控MMPs的影響。
　　方法：
　　1.細胞分組同第一部分。
　　2.采用Real-time PCR和Western blot檢測各組細胞中αvβ6的表達以及ETS家族相關轉錄因子ETS1、ETS2以及ELK1的表達。
　　3.采用熒光素酶報告基因(Luciferase)檢測方法，檢測整合素αvβ6誘導MMP-3和MMP-9基因表達過程中

8、是否涉及轉錄因子ETS1。
　　結果：
　　1.Real time-PCR和Western blot結果顯示，在結腸癌細胞系HT29與WiDr中，干擾β6的表達后，ETS1、ETS2以及ELK1的總的mRNA和蛋白表達量無明顯改變，而ETS1的活化形式一磷酸化ETS1(p-ETS1)表達量明顯下降，磷酸化ETS2(p-ETS2)和磷酸化ELK1(p-ELK1)仍然沒有變化。
　　2.在結腸癌細胞系SW480中，過表達β

9、6之后，相較于野生型SW480和mockSW480，磷酸化ETS1(p-ETS1)明顯升高，磷酸化ETS2(p-ETS2)和磷酸化ELK1(p-ELK1)未見明顯改變
　　3.Luciferase結果顯示，將ETS1 siRNA轉入HT29與WiDr細胞系中，MMP-3和MMP-9的啟動子活性有明顯降低，而MMP-2的活性無明顯變化。
　　結論及意義：
　　本部分實驗揭示，結腸癌細胞系HT29與WiDr中，整合素αvβ

10、6均可有效的促進ETS1的活化，在結腸癌細胞系SW480，過表達β6之后亦可促進ETS1的磷酸化。同時，ETS1可以提高MMP-3和MMP-9啟動子的活性，ERK/MAPK信號通路，整合素αvβ6質膜穿梭和整合素αvβ6-ERK2直接連接在轉錄因子ETS1介導整合素αvβ6調控MMPs機制研究過程中發(fā)揮了不可或缺的作用。本部分研究明確了整合素αvβ6在基因轉錄層面上調控MMPs表達的具體機制，為下一步研究整合素αvβ6促進結腸癌侵襲轉移

11、機制的研究打下基礎。
　　第三部分 整合素αvβ6通過ERK-ETS1通路促進結腸癌細胞侵襲轉移
　　目的：
　　研究整合素αvβ6促進結腸癌細胞侵襲轉移相關細胞信號傳導通路。
　　方法：
　　1.在HT29與WiDr細胞系中，加入PD98059，primaquine或者ETS1 siRNA之后，Real-time PCR和ELISA檢測MMP-3/MMP-9在mRNA和蛋白水平上表達變化。
　　2.

12、在已經穩(wěn)定干擾β6表達的HT29與WiDr中轉入pcDNA-ETS1質粒，Real-timePCR和ELISA檢測其MMP-3/MMP-9在mRNA和蛋白水平上表達變化。3.在過表達β6的SW480中，加入PD98059，primaquine，或者ETS1 siRNA之后，Real-time PCR和ELISA檢測MMP-3/MMP-9在mRNA和蛋白水平上表達變化。
　　4.在HT29細胞中，給予整合素β6抗體10D5對整合素β

13、6進行阻斷，使用PD98059抑制ERK活化，或者采用ETS1 siRNA抑制ETS1表達，采用Transwell侵襲小室和細胞劃痕實驗檢測HT29的侵襲和遷移能力變化。
　　5.將SW480細胞分為三組:轉染空白質粒組(mock transfectant)，轉染β6組(β6 transfectant)，以及轉染含有β6突變基因質粒組(SW480 Mutantβ6transfectant)，在各組細胞中，加入10D5阻斷整合素β6

14、，給予抑制劑PD98059抑制ERK活化或者給予ETS1 siRNA抑制ETS1表達之后，采用Transwell侵襲小室和細胞劃痕實驗檢測各組細胞侵襲和遷移能力變化。
　　結果：
　　1.Real-time PCR結果顯示在HT29與WiDr細胞系中，加入PD98059，primaquine或者ETS1 siRNA之后，MMP-3/MMP-9在mRNA表達量明顯下降。同時ELISA結果顯示MMP-3/MMP-9在蛋白水平上表

15、達同樣明顯降低。
　　2.在已經穩(wěn)定干擾β6表達的HT29與WiDr中轉入pcDNA-ETS1質粒，Real-timePCR和ELISA結果顯示，在mRNA和蛋白水平上，干擾β6所引起的下降的MMP-3/MMP-9，在過表達ETS1之后均再次上升。
　　3.在過表達β6的SW480中，Real-time PCR和ELISA結果顯示，因過表達β6而表達增加的MMP-3/MMP-9，在加入PD98059，primaquine，或

16、者ETS1siRNA之后再次降低。
　　4.在HT29細胞中，與未作任何處理的野生型HT29細胞相比，給予整合素β6抗體10D5對整合素β6進行阻斷，使用PD98059抑制ERK活化，或者采用ETS1 siRNA抑制ETS1表達均可明顯減弱HT29的侵襲或者遷移能力。
　　5.在轉染β6的SW480中組中，加入10D5阻斷整合素β6，給予抑制劑PD98059抑制ERK活化或者給予ETS1 siRNA抑制ETS1表達，Tran

17、swell侵襲小室實驗和細胞劃痕實驗顯示細胞的侵襲或者遷移能力明顯下降，相對而言，加入IgG2a并未影響細胞的侵襲能力，而在SW480 mock transfectant和Mutantβ6transfectant組中，細胞的侵襲和遷移能力沒有降低。
　　結論及意義：
　　本部分實驗揭示，整合素αvβ6通過ERK-ETS1通路促進結腸癌細胞侵襲轉移，并與整合素αvβ6質膜穿梭和整合素αvβ6-ERK2直接連接密不可分。本部分研