LSD1調(diào)控結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選及鑒定.pdf

1、第一部分、LSD1表觀遺傳修飾的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游靶基因的篩選
　　目的：利用人類基因表達譜芯片和ChIP技術(shù)探測結(jié)腸癌細胞中LSD1調(diào)控的下游靶基因，為后續(xù)實驗做好準備。
　　方法：
　?。?）細胞系培養(yǎng):人結(jié)腸癌細胞株SW620、HT-29細胞來源于中南大學湘雅醫(yī)學院細胞研究中心。10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基作為SW620細胞的培養(yǎng)液;10%胎牛血清的RPMI1640培基作為HT-29細胞的培養(yǎng)液。
　　（2

2、）細胞轉(zhuǎn)染及分組：構(gòu)建、合成LSD1過表達載體及siRNA-LSD1有效片段，脂質(zhì)體2000介導轉(zhuǎn)染LSD1-siRNA入SW620細胞，脂質(zhì)體2000介導轉(zhuǎn)染LSD1過表達載體入HT-29細胞。將實驗細胞分為6組，A組：結(jié)腸癌細胞株SW620, B組：SW620+negative control(NC)，C組：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LSD1-siRNA的SW620細胞（SW620+LSD1-siRNA)，G1組：結(jié)腸癌細胞株HT-29，G2組：HT

3、-29+negative control(NC)，G3組：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LSD1-overexpression的HT-29細胞（HT-29+LSD1-overexpression）。
　?。?）利用人類基因表達譜芯片獲取LSD1高表達導致的結(jié)腸癌細胞基因表達改變集：通過對六個實驗細胞組進行基因芯片檢測。根據(jù)log2(ratio)與p-value(Differentially expressed)的大小可挑選有顯著差異表現(xiàn)的探針確定差異表

4、達基因{有顯著差異表達的條件為|log2(Ratio)|>=1 and P-value(Differentially expressed)＜0.05}。
　?。?）Real-time PCR及Western blot驗證：隨機選取其中10個靶基因，利用Real-time RT-PCR、Western Blot在結(jié)腸癌細胞SW620、HT-29細中驗證是否與基因表達譜芯片分析結(jié)果吻合。
　?。?）利用生物信息學技術(shù)確定與轉(zhuǎn)移相

5、關(guān)的靶基因，利用Gene Ontology的分類和聚類分析,按照其參與的生物學過程（Biological Process）和分子功能（MolecularFunction）進行了功能分類，確定與轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因。再利用Pathway Studio數(shù)據(jù)庫分析每個因子的作用通路，顯示LSD1及轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因在已知信號通路中的位置，揭示LSD1與靶基因在整個信號通路中的相互作用關(guān)系，并選擇最有意義的基因進行后續(xù)研究。
　　結(jié)果：

6、　?。?）基因表達譜芯片分析結(jié)果顯示，具備篩選標準(篩選條件為log2|Fold change|≥1且 P＜0.05)的差異表達基因共有8275個,其中明顯上調(diào)的基因有3633個，基因明顯下調(diào)的差異表達基因有4642個。為保證結(jié)果的可靠性，進一步使LSD1基因在結(jié)腸癌細胞株HT-29中過表達（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LSD1基因的全長cDNA序列至HT-29細胞），重復上述實驗，驗證上述差異表達的基因，結(jié)果顯示，符合篩選標準(同上)的差異表達基因共有8

7、287個，其中4047個基因明顯上調(diào)，4240個基因明顯下調(diào)。
　?。?）通過進一步篩選我們得到1528個在實驗組和對照組表達差異在3倍以上的基因,在sw620細胞中,實驗組(C/A)及對照組(C/B)同時表達的差異表達基因數(shù)為101個（log2|Fold change|≥3且 P＜0.05）。在HT-29細胞中,實驗組(G3/G1)和對照組(G3/G2)同時表達的差異表達基因數(shù)為106個（log2|Fold change|≥3且

8、 P＜0.05）。在實驗組(C/A)中差異表達基因為高表達（或低表達），同時在實驗組(G3/G1)中為低表達（或高表達）的差異表達基因數(shù)為20個（log2|Fold change|≥3且P＜0.05）。通過比對分析，我們篩選出以下20個LSD1調(diào)控的下游靶基因：CDH1、ADGRF1、BDNF、CD40、EREG、S100A14、VAV1、AKR1B1、CENPA、F2R、NFIB、NR4A2、MAGEA6|MAGEA3、CABYR、F

9、OXF2、NELL2、TLE4、COPZ2、SLC9A2、STAP-2。
　　（3）Real-time PCR實驗驗證結(jié)果表明下游靶基因CABYR、FOXF2、NELL2和TLE4在實驗組SW620+LSD1-siRNA中mRNA高表達（P＜0.05），在實驗組HT-29+LSD1-overexpression中mRNA低表達（P＜0.05）。而下游靶基因ADGRF1、BDNF、CD40、EREG、S100A14和VAV1則在實驗

10、SW620+LSD1-siRNA中mRNA顯著低表達（P＜0.05），在實驗組HT-29+LSD1-overexpression中mRNA顯著高表達（P＜0.05），結(jié)果表明靶基因在轉(zhuǎn)錄水平RNA的相對表達量變化趨勢與芯片篩選的差異表達基因相對表達量變化趨勢相一致。在蛋白水平上的實驗結(jié)果證實目的基因的Western blot蛋白表達結(jié)果重復了基因芯片結(jié)果的變化趨勢。以上驗證結(jié)果表明芯片篩選結(jié)果是準確可靠的。
　?。?）對差異表達倍

11、數(shù)排序前十的差異表達基因進行Gene Ontology和Pathways顯著性分析，結(jié)果顯示在GO注釋與功能分類報告對應(yīng)的差異表達基因中,與分子功能相關(guān)有6930條;與生物學過程相關(guān)的有2878條;和細胞組分有關(guān)的有7306條；在分子功能中,87.27%的差異表達基因與苷酸結(jié)合相關(guān)，其次為ATP結(jié)合相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合相關(guān);在生物學過程中,有59.97%的差異表達基因與細胞內(nèi)分子及蛋白質(zhì)分解代謝相關(guān)的,另外比例較高的有細胞凋亡、細胞周期等

12、;在細胞組分方面,29.65%的差異表達基因與非膜結(jié)合細胞器相關(guān),細胞膜相關(guān)占16.25%; KEGG信號通路富集分析，表明排序前十的差異表達基因主要參與p53信號通路、癌癥信號通路、泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解、軸突導向信號通路、氨基酰-tRNA合成酶、小細胞肺癌、細胞周期、嘧啶代謝、B細胞受體信號通路、慢性粒細胞白血病。
　　(5)利用生物信息學技術(shù)（Gene Ontology, Pathway studio）進一步確定 LSD1調(diào)控

13、的影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的，并與結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡、腫瘤的發(fā)生相關(guān)的靶基因。并選擇了相應(yīng)的具有代表性意義的4個基因CABYR、FOXF2、TLE4、CDH1進行后續(xù)的研究。
　　結(jié)論：（1）利用基因表達芯片對靶向沉默LSD1基因的SW620結(jié)腸癌細胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LSD1-過表達載體的HT-29細胞進行基因檢測。在這兩種癌細胞株中探測到大量差異表達的基因（明顯上調(diào)或下調(diào)），提示 LSD1調(diào)控的下游靶基因在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的過程中可能發(fā)揮重要作

14、用。
　　（2）確定了能影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶基因即可確定為結(jié)腸癌中受 LSD1表觀遺傳修飾的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游靶基因。通過比對分析在結(jié)腸癌細胞株中篩選出的CABYR、FOXF2、TLE4、CDH14個基因的差異表達與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為后面的研究奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分、探討LSD1調(diào)控結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制
　　目的：探討結(jié)腸癌細胞是否通過改變LSD1與其下游靶基因的結(jié)合豐度，繼而下調(diào)靶基因啟動子區(qū)域H3k

15、4、H3k9的甲基化水平而影響靶基因的表達，結(jié)合人類基因表達譜芯片分析結(jié)果，進一步確定LSD1表觀遺傳修飾的下游靶基因。從而初步闡明LSD1影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，探討LSD1調(diào)控表觀遺傳修飾的可能機制。
　　方法：選擇前期研究篩選出的4個靶基因（CABYR、FOXF2、T LE4、CDH1）利用LSD1、H3K4me2、H3K4me、H3K9me2、H3K9me單克隆抗體，分離出與其結(jié)合的潛在LSD1下游靶基因啟動子，PC

16、R檢測該啟動子區(qū)域，普通半定量PCR的強度代表目的基因啟動子的豐度，同時也代表H3K4me2、H3K4me、H3K9me2、H3K9me強度。通過染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)分別檢測每個靶基因的6個實驗組即A. SW620細胞(空白對照),B.SW620細胞+NC-siRNA(陰性照),C.SW620細胞+LSD1-siRNA，G1.HT-29細胞(空白對照),G2.HT-29細胞+ NC空白載體(陰性對照),G3.HT-29細胞+

17、 LSD1過表達載體，檢測內(nèi)容包括：①LSD1與其下游靶基因啟動子區(qū)域的結(jié)合豐度；②LS D1下游靶基因啟動子區(qū)域組蛋白H3第4位賴氨酸的二甲基(H3K4m e2)和一甲基(H3K4me)水平，以及組蛋白H3第9位賴氨酸的二甲基(H3K9me2)和一甲基(H3K9me)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）LSD1與下游靶點靶基因啟動子結(jié)合的分析結(jié)果:LSD1低表達組（LSD1-siRNA）和LSD1過表達組（HT-29+LSD1-

18、overexp ression）均與靶基因CABYR的啟動子區(qū)域結(jié)合能夠產(chǎn)生DNA-蛋白復合體，且下調(diào)LSD1可增加目的基因CABYR的表達水平，增加幅度比較明顯（P＜0.01），而過表達LSD1可降低目的基因CABYR的表達水平。低表達LSD1組（LSD1- siRNA）和過表達組（HT-29+LSD1-overexpression）均與靶基因CDH1(E-cad)的啟動子區(qū)域結(jié)合能夠產(chǎn)生D NA-蛋白復合體，且結(jié)果提示低表達LSD1

19、可一定程度上增加目的基因CDH1的表達水平（P＜0.01），過表達LSD1可降低目的基因CDH1的表達水平。結(jié)果顯示，靶基因FOXF2、TLE4的CHIP組未見條帶，上調(diào)或下調(diào)LSD1均對目的基因FOXF2、TLE4的表達水平無明顯影響，即LSD1可能并未直接調(diào)控FOXF2、TLE4基因。
　?。?）下游靶基因表達水平與組蛋白H3K4、H3K9甲基化水平結(jié)果分析：低表達LSD1組（LSD1-siRNA）明顯增加靶基因CABYR啟動

20、子區(qū)H3K4me2甲基化程度（P＜0.01），低表達LSD1對CABYR啟動子區(qū)域H3K4me、H3K9me/2甲基化無影響。低表達LSD1明顯增加靶基因CDH1(E-cad)啟動子區(qū)H3K4me2甲基化程度（P＜0.01），而對CDH1(E-cad)啟動子區(qū)域H3K4me、H3K9me/2甲基化無影響。
　　過表達組（HT-29+LSD1-overexpression）對下游靶基因啟動子區(qū)域H3K4me1/2甲基化有明顯作用,過

21、表達LSD1明顯降低靶基因CABYR啟動子區(qū)H3K4me1（P＜0.05）、H3K4me2（P＜0.01）甲基化程度，上調(diào)LSD1對CABYR啟動子區(qū)域H3K9me/2甲基化無影響。上調(diào)LSD1顯降低靶基因CDH1(E-cad)啟動子區(qū)H3K4me2甲基化程度（P＜0.01），對CDH1(E-cad)啟動子區(qū)域H3K4me、H3K9me/2甲基化無影響。
　　CHIP結(jié)果顯示，上調(diào)或下調(diào)LSD1并不改變靶基因FOXF2和TLE4總

22、的H3K9me1/2與H3K4me1/2的甲基化水平。
　　結(jié)論：
　　（1）在人結(jié)腸癌細胞株SW620細胞中，LSD1與其表觀遺傳修飾的下游靶基因CABYR和CDH1(E-cad)基因啟動子區(qū)組蛋白H3K4me2甲基化水平呈負相關(guān),而在HT-29人結(jié)腸癌細胞株中LSD1與其表觀遺傳修飾的下游靶基因CABYR基因啟動子區(qū)組蛋白H3K4me1/2甲基化水平呈正相關(guān)，與CDH1(E-cad)基因啟動子區(qū)組蛋白H3K4me2甲基化

23、水平呈正相關(guān)。同時證明了CABYR和CDH1(E-cad)基因為與轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因，其表達的上調(diào)或下調(diào)可能是影響結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的原因。
　?。?）闡明了結(jié)腸癌細胞是通過改變LSD1與其下游靶基因的結(jié)合豐度，繼而下調(diào)靶基因啟動子區(qū)域H3K4me1、H3K4me2的甲基化水平而影響靶基因的表達，這為進一步研究LSD1影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分、驗證LSD1調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因?qū)Y(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響

24、>　　目的：在細胞水平驗證轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因?qū)Y(jié)腸癌細胞遷移、侵襲能力的影響，通過驗證的能影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶基因即可確定為結(jié)腸癌中受 LSD1表觀遺傳修飾的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游靶基因。
　　方法：分別利用侵襲性較強的SW620細胞進行驗證，各自分為為3個組，未處理組(blank)、陰性對照組(scramble)和處理組（轉(zhuǎn)染siRNA），即以未轉(zhuǎn)染的SW620細胞（A組）和轉(zhuǎn)染空載體SW620細胞組（B組：SW620細胞+轉(zhuǎn)染空載體組

25、）作為對照，處理組（C組：SW620細胞+siRNA-CABYR/CDH1）通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默靶基因的表達，利用Transwell細胞體外遷移/侵襲實驗驗證轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因?qū)Y(jié)腸癌細胞遷移、侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：在通過沉默靶基因（siRNA-CABYR）處理的結(jié)腸癌SW620細胞中,與陰性對照處理組細胞相比,其侵襲能力(40.00±4.06vs69.50±2.25，68.50±5.02; P＜0.05)均顯著減弱。在通過沉

26、默靶基因（siRNA-CDH1）處理的結(jié)腸癌SW620細胞中，與陰性對照處理組細胞相比,其侵襲能力(116.25±4.38vs59.50±3.84，58.25±4.82; P＜0.05)均顯著增強。轉(zhuǎn)染 siRNA-CABYR基因組結(jié)腸癌SW620細胞與對照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組）細胞相比較，其侵襲能力有減弱。轉(zhuǎn)染 siRNA- CDH1基因組結(jié)腸癌SW620細胞與對照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組）細胞相比較，其侵襲能力有增強。