結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系SW480-M5及其轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)的篩選和鑒定.pdf

1、腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多基因改變、多步驟發(fā)展的復(fù)雜過(guò)程。在演化過(guò)程中由于瘤細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定性和宿主環(huán)境的選擇壓力，使細(xì)胞不斷變異，產(chǎn)生分化及表型的多樣性，因此，在同一瘤體內(nèi)，含有生物學(xué)特性和轉(zhuǎn)移行為不完全相同的亞克隆細(xì)胞。腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生是宿主與惡性腫瘤細(xì)胞相互作用的結(jié)果，是一個(gè)高選擇性的過(guò)程，只有具有轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞亞群才能發(fā)生轉(zhuǎn)移，并且轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞具有一定的組織傾向性，這是瘤細(xì)胞與特定的器官微環(huán)境相互作用的結(jié)果。因此，分離并鑒

2、定出具有不同轉(zhuǎn)移方向的腫瘤細(xì)胞亞克隆，有針對(duì)性地比較和分析它們?cè)谏飳W(xué)特性方面的差別，對(duì)于探討腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制、尋找腫瘤預(yù)防和治療的有效途徑有重要的理論和實(shí)際意義。 人癌轉(zhuǎn)移模型的原位移植戰(zhàn)略是研究人癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要理論基礎(chǔ)，研究表明，人癌細(xì)胞在宿主體內(nèi)表達(dá)侵襲能力，不但需要具備合適的移植環(huán)境，而且還依賴瘤細(xì)胞之間，瘤細(xì)胞與間質(zhì)之間，瘤細(xì)胞與宿主之間的相互作用。因此，在腫瘤原位移植模型中，應(yīng)用組織學(xué)完整的瘤塊比用腫瘤細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移

3、發(fā)生率高，組織塊的外科原位接種模型轉(zhuǎn)移的可信性高，其轉(zhuǎn)移的發(fā)生有與臨床相似的時(shí)間依賴性，而不是移植過(guò)程中的細(xì)胞播散。裸鼠可以消除宿主免疫監(jiān)視對(duì)瘤細(xì)胞的影響，腫瘤原位移植的微環(huán)境與原發(fā)的器官相似，因此，瘤組織的裸鼠體內(nèi)原位移植能使瘤細(xì)胞與宿主體內(nèi)微環(huán)境相適應(yīng)，從而使腫瘤的生物學(xué)行為和自然屬性得以充分表達(dá)。 根據(jù)腫瘤轉(zhuǎn)移的這一特性，本研究利用裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代及組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法從具有多向轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中篩選出肝轉(zhuǎn)移的

4、細(xì)胞亞系SW480/M5，并進(jìn)一步以SW480及與SW480有同源性的SW620細(xì)胞為對(duì)照對(duì)SW480/M5的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定。 首先利用外科原位接種的方法對(duì)三種細(xì)胞活體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行了檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：SW480具有多向轉(zhuǎn)移的潛能，肝、肺、淋巴結(jié)均發(fā)生了轉(zhuǎn)移，尤其腹腔種植轉(zhuǎn)移能力明顯強(qiáng)于其他兩種細(xì)胞；SW620僅出現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移；而SW480/M5則僅出現(xiàn)肝臟的轉(zhuǎn)移。說(shuō)明由于取材部位的不同三種細(xì)胞具有不同的組織傾向性，SW

5、480取自原發(fā)腫瘤，包含多個(gè)不同的亞克隆細(xì)胞群；而SW480/M5以及SW620則是從轉(zhuǎn)移灶取材建立的細(xì)胞系，他們分別具有肝臟及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的傾向性；因此，我們可以認(rèn)為SW480/M5以及SW620細(xì)胞是SW480細(xì)胞中含有的兩個(gè)亞群。SW480/M5以及SW620荷瘤鼠雖然出現(xiàn)了遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移，但是出于沒(méi)有腹腔種植轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)隔部位的轉(zhuǎn)移灶又比較小，消耗不是很?chē)?yán)重，因此荷瘤鼠精神狀態(tài)較好。雖然我們?cè)囼?yàn)中裸鼠是同時(shí)處死的，但是我們認(rèn)為SW480/M

6、5以及SW620荷瘤鼠的生存期應(yīng)該較SW480荷瘤鼠生存期長(zhǎng)，用這兩種細(xì)胞建立的結(jié)腸癌模型應(yīng)該是研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床治療方案的理想模型。 腫瘤轉(zhuǎn)移中最基本的步驟就是瘤細(xì)胞可以運(yùn)動(dòng)到腫瘤周?chē)慕M織以及脈管系統(tǒng)中，遺傳突變使得部分細(xì)胞具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力，且在疾病早期階段僅有一小部分細(xì)胞亞型具有該能力。本試驗(yàn)中利用運(yùn)動(dòng)小室的方法對(duì)三種細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行了比較，運(yùn)動(dòng)小室分為上下兩個(gè)槽，中間由8μm微孔濾膜分開(kāi)，上室加入不含有

7、血清的不完全培養(yǎng)基，下室加入含有血清的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞要進(jìn)入下室必須具備變形和運(yùn)動(dòng)的能力，才能穿過(guò)微孔膜，比較相同時(shí)間內(nèi)穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)，可以反應(yīng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的差異。我們的試驗(yàn)結(jié)果顯示SW480/M5的運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)于SW480及SW620細(xì)胞。然而在活體內(nèi)瘤細(xì)胞向周?chē)M織運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)遇到一系列的自然屏障，如結(jié)締組織基質(zhì)、基底膜等，瘤細(xì)胞單靠其運(yùn)動(dòng)能力是不能穿過(guò)這些屏障的，這就依賴于能降解基質(zhì)和基底膜成分的酶的分泌。我們?cè)谠囼?yàn)中利用侵襲小室對(duì)三

8、種細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)行了比較，侵襲小室的結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)小室一樣，僅僅是在微孔濾膜的表面被覆有一層人工基底膜膠，細(xì)胞在穿過(guò)微孔進(jìn)入下室之前必須先降解基質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果顯示SW480/M5細(xì)胞的侵襲能力強(qiáng)于SW480及SW620細(xì)胞。血管內(nèi)的瘤細(xì)胞在穿出管壁后多數(shù)被宿主的防御系統(tǒng)殺死或抑制，只有增殖力和侵襲力強(qiáng)者方能得以存活及形成轉(zhuǎn)移灶。因此，我們又對(duì)SW480/M5的增殖能力進(jìn)行了檢驗(yàn)。首先利用MTT及克隆形成的方法檢驗(yàn)細(xì)胞體外增殖能力：96孔板中

9、，SW480/M5及SW620細(xì)胞在接種后的第二天，細(xì)胞數(shù)目就超過(guò)了SW480細(xì)胞；克隆形成率試驗(yàn)顯示SW480/M5及SW620單個(gè)細(xì)胞的增殖能力分別是SW480細(xì)胞的1.64和1.52倍。其次利用裸鼠皮下成瘤性試驗(yàn)檢驗(yàn)了三種細(xì)胞在活體內(nèi)的增殖能力：從細(xì)胞注射后的第九天SW480/M5及SW620皮下瘤的體積超過(guò)了SW480細(xì)胞，說(shuō)明前兩者的體內(nèi)增殖能力較強(qiáng)，與體外試驗(yàn)結(jié)果一致。 一系列的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明我們利用裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代的方法

10、從SW480細(xì)胞系中篩選出的肝轉(zhuǎn)移亞系SW480/M5轉(zhuǎn)移的組織傾向性明顯，且運(yùn)動(dòng)、侵襲、增殖能力強(qiáng)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，能夠從整體水平上大規(guī)模地對(duì)組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾、細(xì)胞內(nèi)定位及蛋白質(zhì)間相互作用等進(jìn)行定量和動(dòng)態(tài)分析，因而彌補(bǔ)了基因組研究無(wú)法提供全部蛋白質(zhì)功能的不足。目前研究腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的思路主要是研究比較同一親本來(lái)源、不同轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系，或者比較原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的差別，尋找與轉(zhuǎn)移相關(guān)的正性或負(fù)性調(diào)控因素。S

11、W480/M5是從SW480細(xì)胞系中篩選出來(lái)的定向肝轉(zhuǎn)移的亞克隆，兩者遺傳背景一致，是進(jìn)行比較蛋白組學(xué)研究的理想材料。 本研究利用雙向凝膠電泳技術(shù)比較的SW480/M5與SWSW480蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，選取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出9個(gè)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選蛋白；并利用熒光定量RT-PCR及Western Blotting技術(shù)對(duì)其中三個(gè)蛋白質(zhì)(Annexin Ⅰ、HMGB1及FSCN1)在兩個(gè)細(xì)胞的mRNA及蛋白質(zhì)