乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及蛋白質(zhì)的篩選與鑒定.pdf

1、第一部分：AF1Q基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其作用機(jī)制 與其它實(shí)體腫瘤相似，遠(yuǎn)處靶器官轉(zhuǎn)移是乳腺癌致死的主要原因。迄今為止，其分子機(jī)制尚不清楚。我們實(shí)驗(yàn)室前期的工作，通過(guò)體內(nèi)連續(xù)篩選方法建立了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠移植瘤模型，以及高肺轉(zhuǎn)移潛能的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435HM，并運(yùn)用高通量的cDNA微陣列技術(shù)比較分析MDA-MB-435HM及其親代MDA-MB-435細(xì)胞系的基因表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)60個(gè)基因顯著差異表達(dá)。

2、其中，癌基因AF1Q在高轉(zhuǎn)移潛能乳腺癌MDA-MB-435HM細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)約4倍。據(jù)Tse等報(bào)道，AF1Q基因上調(diào)表達(dá)與白血病及甲狀腺癌發(fā)生有關(guān)。但迄今為止，尚不清楚AF1Q基因是否參與了乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程，以及在乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的作用機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)探討AF1Q基因在體內(nèi)、外對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其可能的作用機(jī)制。以RT-PCR方法驗(yàn)證AF1Q基因在MDA-MB-435HM及其親代MDA-MB-435細(xì)胞中的差異表達(dá)(

3、cDNA微陣列分析結(jié)果)；通過(guò)RT-PCR介導(dǎo)的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)添加法構(gòu)建AF1Q真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/AF1Q；通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)，將pcDNA3.1/AF1Q質(zhì)粒導(dǎo)入人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞株，應(yīng)用抗生素G418篩選及RT-PCR鑒定，構(gòu)建AF1Q穩(wěn)定表達(dá)的MDA-MB-435細(xì)胞株；以穩(wěn)定表達(dá)AF1Q基因的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435/AF1Q為研究對(duì)象，運(yùn)用Transwell方法觀察轉(zhuǎn)染前后

4、各組細(xì)胞在體外侵襲能力的變化，并采用RT-PCR、Westernblotting、明膠酶譜技術(shù)及ELISA方法檢測(cè)相關(guān)基因(MMP-1，MMP-2，MMP-7，MMP-9Ets-1，TIMP-1，TIMP-2，uPA，uPAR，cathepsinD，maspin，cystatinC，VEGF，bFGF及RhoC)表達(dá)的變化；采用RNA干擾(RNAi)實(shí)驗(yàn)，探討AF1Q下調(diào)表達(dá)對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞體外侵襲潛能的影響，并以Wester

5、nblotting方法觀察相關(guān)基因表達(dá)的變化；建立相應(yīng)的人癌裸鼠原位移植瘤模型以驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果；應(yīng)用RT-PCR方法分析AF1Q基因在臨床乳腺癌組織中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果顯示，AF1Q基因在MDA-MB-435HM細(xì)胞中顯著高表達(dá)，與cDNA微陣列結(jié)果相似。通過(guò)分子克隆方法成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/AF1Q。外源性AF1Q基因和空載體pcDNA3.1通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)染入MDA-MB-435細(xì)胞，經(jīng)G

6、418篩選得到兩個(gè)陽(yáng)性克隆MDA-MB-435/AF1Q1及MDA-MB-435/AF1Q2。RT-PCR分析顯示，與親代MDA-MB-435細(xì)胞及空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，MDA-MB-435/AF1Q1及MDA-MB-435/AF1Q2細(xì)胞分別上調(diào)表達(dá)AF1Q基因?yàn)?.1及5.2倍。與對(duì)照組比較，AF1Q轉(zhuǎn)染的MDA-MB-435細(xì)胞體外侵襲能力提高約2倍，MMP-2，MMP-9，轉(zhuǎn)錄因子Ets-1以及RhoCmRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)

7、，而各組細(xì)胞中MMP-1，MMP-7，TIMP-1，TIMP-2，uPA，uPAR，cathepsinD，maspin，cystatinC，VEGF及bFGF表達(dá)水平均未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05)。RNAi實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，RNAi組的MDA-MB-435細(xì)胞下調(diào)AF1Q表達(dá)約65％，且抑制MDA-MB-435細(xì)胞的體外侵襲能力，下調(diào)MMP-2，MMP-9，ets-1及RhoC蛋白的表達(dá)。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，AF1Q能促進(jìn)原位腫瘤

8、生長(zhǎng)、肺轉(zhuǎn)移病灶的形成，以及上調(diào)移植瘤組織中MMP-2，MMP-9，ets-1及RhoC蛋白的表達(dá)。RT-PCR方法分析50例臨床外科切除的乳腺癌組織標(biāo)本，結(jié)果顯示AF1Q基因在78％(39/50)的乳腺癌組織中高表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，AF1Q高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(Fisher'sExacttest；P=0.037)。這些結(jié)果表明，AF1Q基因能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移潛能，可能與其上調(diào)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2，MMP-9

9、，ets-1及RhoC的表達(dá)有關(guān)。 第二部分：乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)候選蛋白質(zhì)的篩選與鑒定 近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在尋找腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物及新的分子治療的藥靶、評(píng)價(jià)藥物的療效方面取得了較大進(jìn)展。但迄今為止，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討乳腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的相關(guān)文獻(xiàn)較少。本研究以本實(shí)驗(yàn)室建立的高、低肺轉(zhuǎn)移潛能人乳腺癌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎玫鞍踪|(zhì)組學(xué)技術(shù)比較其蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異，以篩選和鑒定乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)。采用固相pH梯度雙向凝膠電泳

10、(2-DE)技術(shù)，分離具有相同遺傳背景的高、低肺轉(zhuǎn)移潛能人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-435HM及MDA-MB-435LM)的總蛋白質(zhì)，銀染顯色，獲得了重復(fù)性和分辨率均較好的雙向電泳銀染圖譜。MDA-MB-43HM及MDA-MB-435LM細(xì)胞6次2-DE圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率分別為93.7％±3.7％及93.6％±3.9％。PDQuest2-DE軟件分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-435HM與MDA-MB-435LM細(xì)胞之間共有

11、102個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)存在3倍以上豐度變化。采用生物質(zhì)譜鑒定技術(shù)，對(duì)部分差異蛋白點(diǎn)用液相色譜-離子阱-質(zhì)譜(LC-IT-MS)分析其膠內(nèi)酶解后的肽譜和各肽段的氨基酸序列，用SEQUEST軟件查詢NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，成功鑒定了11個(gè)乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)候選蛋白質(zhì)，包括組織蛋白酶前體(CATD)、peroxiredoxin6(PDX6)、α晶狀體球蛋(CRAB)、原肌球蛋白1-4(TPM1-4)、熱休克蛋白60(HSP60)及腫瘤蛋白D54(TD54

12、)等，這些候選蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能以及許多未知功能。隨機(jī)選取了4個(gè)差異候選蛋白質(zhì)，包括抗氧化蛋白peroxiredoxin6(PDX6)、α晶狀體球蛋白(CRAB)、熱休克蛋白60(HSP60)以及原肌球蛋白質(zhì)4(TPM4)，用RT-PCR及Westernblotting方法在高、低肺轉(zhuǎn)移潛能的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435HM及MDA-MB-435LM中驗(yàn)證，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)論基本一致。