乳腺癌轉移相關基因及蛋白質的篩選與鑒定.pdf

1、第一部分：AF1Q基因對乳腺癌細胞侵襲轉移潛能的影響及其作用機制 與其它實體腫瘤相似，遠處靶器官轉移是乳腺癌致死的主要原因。迄今為止，其分子機制尚不清楚。我們實驗室前期的工作，通過體內連續(xù)篩選方法建立了乳腺癌肺轉移裸鼠移植瘤模型，以及高肺轉移潛能的人乳腺癌細胞株MDA-MB-435HM，并運用高通量的cDNA微陣列技術比較分析MDA-MB-435HM及其親代MDA-MB-435細胞系的基因表達譜差異，發(fā)現(xiàn)60個基因顯著差異表達。

2、其中，癌基因AF1Q在高轉移潛能乳腺癌MDA-MB-435HM細胞中上調表達約4倍。據(jù)Tse等報道，AF1Q基因上調表達與白血病及甲狀腺癌發(fā)生有關。但迄今為止，尚不清楚AF1Q基因是否參與了乳腺癌轉移過程，以及在乳腺癌轉移過程的作用機制。 本實驗探討AF1Q基因在體內、外對人乳腺癌細胞株侵襲轉移潛能的影響及其可能的作用機制。以RT-PCR方法驗證AF1Q基因在MDA-MB-435HM及其親代MDA-MB-435細胞中的差異表達(

3、cDNA微陣列分析結果)；通過RT-PCR介導的限制性核酸內切酶位點添加法構建AF1Q真核表達質粒pcDNA3.1/AF1Q；通過脂質體介導的基因穩(wěn)定轉染技術，將pcDNA3.1/AF1Q質粒導入人乳腺癌MDA-MB-435細胞株，應用抗生素G418篩選及RT-PCR鑒定，構建AF1Q穩(wěn)定表達的MDA-MB-435細胞株；以穩(wěn)定表達AF1Q基因的人乳腺癌細胞MDA-MB-435/AF1Q為研究對象，運用Transwell方法觀察轉染前后

4、各組細胞在體外侵襲能力的變化，并采用RT-PCR、Westernblotting、明膠酶譜技術及ELISA方法檢測相關基因(MMP-1，MMP-2，MMP-7，MMP-9Ets-1，TIMP-1，TIMP-2，uPA，uPAR，cathepsinD，maspin，cystatinC，VEGF，bFGF及RhoC)表達的變化；采用RNA干擾(RNAi)實驗，探討AF1Q下調表達對MDA-MB-435細胞體外侵襲潛能的影響，并以Wester

5、nblotting方法觀察相關基因表達的變化；建立相應的人癌裸鼠原位移植瘤模型以驗證體外實驗的觀察結果；應用RT-PCR方法分析AF1Q基因在臨床乳腺癌組織中的表達及其與淋巴結轉移的關系。結果顯示，AF1Q基因在MDA-MB-435HM細胞中顯著高表達，與cDNA微陣列結果相似。通過分子克隆方法成功構建真核表達質粒pcDNA3.1/AF1Q。外源性AF1Q基因和空載體pcDNA3.1通過脂質體介導成功轉染入MDA-MB-435細胞，經(jīng)G

6、418篩選得到兩個陽性克隆MDA-MB-435/AF1Q1及MDA-MB-435/AF1Q2。RT-PCR分析顯示，與親代MDA-MB-435細胞及空載體轉染細胞相比，MDA-MB-435/AF1Q1及MDA-MB-435/AF1Q2細胞分別上調表達AF1Q基因為5.1及5.2倍。與對照組比較，AF1Q轉染的MDA-MB-435細胞體外侵襲能力提高約2倍，MMP-2，MMP-9，轉錄因子Ets-1以及RhoCmRNA和蛋白表達均明顯上調

7、，而各組細胞中MMP-1，MMP-7，TIMP-1，TIMP-2，uPA，uPAR，cathepsinD，maspin，cystatinC，VEGF及bFGF表達水平均未見明顯變化(P＞0.05)。RNAi實驗顯示，與對照組相比，RNAi組的MDA-MB-435細胞下調AF1Q表達約65％，且抑制MDA-MB-435細胞的體外侵襲能力，下調MMP-2，MMP-9，ets-1及RhoC蛋白的表達。裸鼠移植瘤實驗表明，AF1Q能促進原位腫瘤

8、生長、肺轉移病灶的形成，以及上調移植瘤組織中MMP-2，MMP-9，ets-1及RhoC蛋白的表達。RT-PCR方法分析50例臨床外科切除的乳腺癌組織標本，結果顯示AF1Q基因在78％(39/50)的乳腺癌組織中高表達。統(tǒng)計分析顯示，AF1Q高表達與淋巴結轉移呈正相關(Fisher'sExacttest；P=0.037)。這些結果表明，AF1Q基因能促進乳腺癌細胞生長、侵襲轉移潛能，可能與其上調細胞侵襲轉移相關基因MMP-2，MMP-9

9、，ets-1及RhoC的表達有關。 第二部分：乳腺癌轉移相關候選蛋白質的篩選與鑒定 近年來，蛋白質組學技術在尋找腫瘤早期診斷的生物標志物及新的分子治療的藥靶、評價藥物的療效方面取得了較大進展。但迄今為止，應用蛋白質組學技術探討乳腺癌轉移發(fā)生的相關文獻較少。本研究以本實驗室建立的高、低肺轉移潛能人乳腺癌細胞株為實驗模型，采用蛋白質組學技術比較其蛋白質表達譜差異，以篩選和鑒定乳腺癌轉移相關蛋白質。采用固相pH梯度雙向凝膠電泳

10、(2-DE)技術，分離具有相同遺傳背景的高、低肺轉移潛能人乳腺癌細胞株(MDA-MB-435HM及MDA-MB-435LM)的總蛋白質，銀染顯色，獲得了重復性和分辨率均較好的雙向電泳銀染圖譜。MDA-MB-43HM及MDA-MB-435LM細胞6次2-DE圖譜蛋白質點的匹配率分別為93.7％±3.7％及93.6％±3.9％。PDQuest2-DE軟件分析差異表達的蛋白質，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-435HM與MDA-MB-435LM細胞之間共有

11、102個蛋白質點存在3倍以上豐度變化。采用生物質譜鑒定技術，對部分差異蛋白點用液相色譜-離子阱-質譜(LC-IT-MS)分析其膠內酶解后的肽譜和各肽段的氨基酸序列，用SEQUEST軟件查詢NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫，成功鑒定了11個乳腺癌轉移相關候選蛋白質，包括組織蛋白酶前體(CATD)、peroxiredoxin6(PDX6)、α晶狀體球蛋(CRAB)、原肌球蛋白1-4(TPM1-4)、熱休克蛋白60(HSP60)及腫瘤蛋白D54(TD54

12、)等，這些候選蛋白質涉及細胞生長代謝、遷移、信號轉導和免疫調節(jié)等多種生物功能以及許多未知功能。隨機選取了4個差異候選蛋白質，包括抗氧化蛋白peroxiredoxin6(PDX6)、α晶狀體球蛋白(CRAB)、熱休克蛋白60(HSP60)以及原肌球蛋白質4(TPM4)，用RT-PCR及Westernblotting方法在高、低肺轉移潛能的人乳腺癌細胞株MDA-MB-435HM及MDA-MB-435LM中驗證，結果與蛋白質組學結論基本一致。