乳腺癌轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其關(guān)鍵因子的功能研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年提高,已成為嚴重威脅女性健康的重大疾病之一。乳腺癌轉(zhuǎn)移是致死的首要原因,轉(zhuǎn)移一旦發(fā)生就預(yù)后不佳,極難治愈。高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為乳腺癌轉(zhuǎn)移研究提供了良好的技術(shù)支持,使人們能夠系統(tǒng)地研究轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)的組成及變化規(guī)律,進而篩選能夠用于靶向藥物設(shè)計的候選蛋白質(zhì)。在本論文研究中,我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),緊緊圍繞乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)問題,開展了一系列尋找轉(zhuǎn)移關(guān)鍵因子的研究。本研究在實驗室已

2、有的微升級質(zhì)譜分析平臺基礎(chǔ)上,升級硬件系統(tǒng),完善軟件系統(tǒng),搭建適用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品鑒定的納升級液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺。標準樣品檢驗表明,該平臺能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品的納升水平穩(wěn)定分離,并且蛋白質(zhì)檢測靈敏度達到飛摩爾水平。該平臺的建立,為我們實驗室有效開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ),也成為本論文開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、艖?yīng)用2D-LC-MS/MS的技術(shù)線路進行乳腺癌血清樣品

3、的蛋白組學(xué)研究,篩選乳腺癌早期轉(zhuǎn)移的生物標志物。通過對三組血清樣品(健康對照組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移DCIS、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移DCIS)的樣品處理、質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)分析,篩選得到了一系列在不同血清樣品組間存在顯著差異表達的蛋白質(zhì)。通過大規(guī)模血清樣品的ELISA驗證表明, TNXB在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病人血清中含量顯著降低,是有潛力的乳腺癌早期轉(zhuǎn)移生物標志物。
　?、茟?yīng)用GeLC-MS/MS的技術(shù)線路通過比較不同轉(zhuǎn)移潛能細胞的分泌組學(xué),篩選介導(dǎo)乳腺

4、癌骨定向轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子,并對某些因子進行了功能驗證。我們選用在人源乳腺癌細胞株MDA231基礎(chǔ)上經(jīng)過單細胞篩選得到的具有不同骨轉(zhuǎn)移能力的單細胞克隆株SCP2、SCP4、SCP6和SCP46,運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定每種細胞的分泌蛋白。經(jīng)過基于非標記定量分析,我們篩選得到了128個與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分泌蛋白,其中有118個蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中沒有被鑒定到。通過生物學(xué)功能分析,我們發(fā)現(xiàn)在這些差異表達分泌蛋白中,酶活性調(diào)節(jié)功能被顯著富集

5、,其中包括多個cystatin家族成員。我們進一步驗證其中的CST6在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的功能。利用CST6過表達或沉默細胞株,在動物水平研究表明,CST6過表達/沉默能顯著抑制/促進乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移,減弱/增強溶骨性損毀,提高/降低小鼠的生存率。我們的工作揭示CST6是一個在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用的重要蛋白質(zhì)。
　?、峭ㄟ^比較4T1系列細胞株的分泌組學(xué)篩選腫瘤誘導(dǎo)機體免疫抑制的關(guān)鍵因子,并進行功能驗證。腫瘤介導(dǎo)的機體免疫抑制在腫瘤

6、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。髓源抑制性細胞(MDSCs)是繼Tregs, TAMs, TADCs后發(fā)現(xiàn)的另一類腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制細胞。我們選用來源于同一小鼠自發(fā)乳腺癌的具有相同遺傳背景、不同轉(zhuǎn)移能力的4 T1系列細胞株(67NR,168FARN,4TO7,4 T1)開展研究。四種細胞株的荷瘤小鼠實驗表明,細胞株的轉(zhuǎn)移能力與其體內(nèi)誘導(dǎo)MDSCs的能力成正比,而且誘導(dǎo)因子來源于具有轉(zhuǎn)移能力腫瘤細胞的分泌蛋白。通過對四種細胞株的分泌組學(xué)研究,我們

7、得到了26個與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白質(zhì),其中包括多種細胞因子、免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)及酶活性調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)。我們挑選其中的G-CSF、U P A和LIF,進一步驗證這幾個因子在小鼠中誘導(dǎo)MDSCs的能力。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞株中高表達的G-CSF能夠在體內(nèi)強烈誘導(dǎo)MDSCs的增殖、動員和募集,并且其誘導(dǎo)的MDSCs具有免疫抑制活性。我們的工作表明G-CSF是誘導(dǎo) MDSCs介導(dǎo)機體免疫抑制、促進腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。
　　⑷搭建了適

8、用于微量復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品鑒定的納升級蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺,并將其應(yīng)用于乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)問題研究。我們基于血清蛋白質(zhì)組學(xué),篩選得到可用于乳腺癌早期轉(zhuǎn)移預(yù)后的生物標志物。通過鑒定比較不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細胞株的分泌蛋白質(zhì)組,并結(jié)合免疫調(diào)節(jié)或器官定向轉(zhuǎn)移的特征,我們獲得了一系列與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵因子,并對其中的某些關(guān)鍵因子進行深入的功能研究。此外,本論文的研究將促進我們對乳腺癌轉(zhuǎn)移的進一步認識和了解,為針對乳腺癌轉(zhuǎn)移的靶向藥物設(shè)計提供了更多的