鈣化型乳腺癌基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的血清診斷模型的建立和鈣化機(jī)制的研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的一種惡性腫瘤，乳腺X線檢查是目前全世界公認(rèn)的應(yīng)用于大范圍人群乳腺癌篩查的最主要的影像學(xué)檢查項(xiàng)目。乳腺x線篩查中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)乳腺的鈣化灶，同時(shí)乳腺癌也常常伴隨鈣化的表現(xiàn)，甚至有時(shí)鈣化是臨床現(xiàn)有乳腺癌檢查手段所能發(fā)現(xiàn)的唯一征象。這對(duì)鈣化病灶的良惡性鑒別提出了更高的要求。血清組分變化可充分反映機(jī)體生理、病理過(guò)程，容易獲取并易于監(jiān)測(cè)，故一直是篩選疾病診斷標(biāo)記物的最佳研究對(duì)象。目前常用的乳腺癌血清標(biāo)記物主要為CA15-3、

2、CA12-5、CEA等，特異性和敏感性不能滿足臨床需求。為此，篩選血清中差異蛋白十分必要。
　　目前研究認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素參與的多環(huán)節(jié)的病理過(guò)程，傳統(tǒng)的單基因研究模式限制了腫瘤相關(guān)因素的研究發(fā)展。近年來(lái)迅速發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，是對(duì)基因組所編碼的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的學(xué)科，能動(dòng)態(tài)、整體、定量地考察疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中全部蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的變化，對(duì)于探討疾病發(fā)病機(jī)理、尋找疾病診斷的特異性標(biāo)志物和藥物治療的靶標(biāo)來(lái)說(shuō)，是一種有效的

3、高通量的研究模式，可獲得一些傳統(tǒng)手段無(wú)法得到的新蛋白標(biāo)志物、新關(guān)鍵分子，極大地豐富了診斷標(biāo)志物的選擇組合，并且有助于復(fù)雜致病機(jī)理的全面闡明。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，使我們對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有了更詳盡的理解，并能夠通過(guò)發(fā)現(xiàn)特異的分子標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)患者和治療效果和預(yù)后。
　　表面加強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface-enhanced laserdesorption/ionization，time-of-flight，mass s

4、pectroscopy，SELDI-TOF-MS)是蛋白質(zhì)組學(xué)新興運(yùn)用的技術(shù)，已有眾多的研究組利用該技術(shù)在患者體液中發(fā)現(xiàn)了能夠早期診斷腫瘤的標(biāo)志物。雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)是基于質(zhì)譜測(cè)定的蛋白質(zhì)組學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法?；|(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization，time-of-flight，masssp

5、ectroscopy，MALDI-TOF-MS)分析肽質(zhì)量指紋圖譜則是檢測(cè)雙向凝膠電泳分離的蛋白的常規(guī)工具。MALDI-TOF-MS通過(guò)計(jì)算肽的飛行時(shí)間進(jìn)行分析，而飛行時(shí)間則和肽的質(zhì)荷比相關(guān)。將獲得的肽質(zhì)量的數(shù)據(jù)和序列數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，就可以獲得較為明確的蛋白鑒定結(jié)果。
　　糖基化是最常見的蛋白質(zhì)修飾，在惡性腫瘤中，大約50％以上的蛋白質(zhì)都有糖基化發(fā)生。許多疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì)糖鏈結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。分析疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)糖基

6、化改變，在探求疾病診療策略和發(fā)現(xiàn)診斷標(biāo)志物方面扮演著越來(lái)越重要的角色。
　　本課題的研究目的就是希望通過(guò)臨床工作中數(shù)字化乳腺X線檢查結(jié)果，分析乳腺鈣化的類型、分布、病理特征等規(guī)律，應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)通過(guò)對(duì)人鈣化型乳腺癌、無(wú)鈣化乳腺癌、良性鈣化和良性無(wú)鈣化對(duì)照組患者血清的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜差異分析，在乳腺X線提示鈣化的乳腺癌患者的血清中尋找與鈣化可能相關(guān)的分子標(biāo)記物，建立乳腺癌，尤其是鈣化型乳腺癌血清蛋白質(zhì)組的診斷模型，對(duì)

7、其進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。并且應(yīng)用2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)篩選鑒定血清中與乳腺癌鈣化的差異蛋白質(zhì)分子，應(yīng)用復(fù)合蛋白質(zhì)組學(xué)(multiplexed proteomics，MP)技術(shù)，獲得血清糖蛋白質(zhì)修飾譜；然后應(yīng)用免疫沉淀和多種凝集素印跡分析差異蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的改變與乳腺癌鈣化發(fā)生的關(guān)系，為進(jìn)一步探討乳腺癌鈣化的形成機(jī)制建立工作基礎(chǔ)。
　　第一部分乳腺X線檢查中乳腺鈣化的特點(diǎn)與規(guī)律分析
　　目的：分析鈣化在乳腺X線成像中

8、的類型、分布、病理特征等規(guī)律。評(píng)價(jià)鈣化在乳腺癌X線診斷中的意義。
　　方法：自2006年3月至2008年2月數(shù)字化乳腺X線檢查的病人3812例，其中女性3807例，男性5例。乳腺X線攝影常規(guī)雙乳拍攝頭尾位(craniocaudal，CC)、外斜位(mediolateral oblique，MLO)。378例病人乳腺X線攝影檢查后在我院接受了手術(shù)治療。所有病灶均經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)。觀察分析乳腺鈣化灶的大小、分布及病理特征。對(duì)64例浸潤(rùn)

9、性導(dǎo)管癌標(biāo)本進(jìn)行雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和C-erbB-2免疫組織化學(xué)染色分析。采用x2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，當(dāng)P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：3812例病人中，乳腺X線攝影發(fā)現(xiàn)存在鈣化灶的有201.8例，占52.9％，其中雙側(cè)乳房均有鈣化的為1045例，占鈣化病例的51.8％。乳腺良惡性病灶均可出現(xiàn)鈣化，良惡性病灶組間比較，惡性鈣化主要表現(xiàn)為病灶內(nèi)的、簇狀的、微小鈣化，鈣化的大小及分布特

10、征的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同鈣化的乳腺導(dǎo)管癌之間免疫組化指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以簇狀分布的微鈣化作為乳腺癌的評(píng)判指標(biāo)，診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為41.7％(78/187)、86.7％(137/158)、78.8％(78/99)、55.7％(137/246)。結(jié)合X線其他表現(xiàn)，乳腺數(shù)字化X線攝影對(duì)乳腺癌診斷的總的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值59.9％(112/18

11、7)、92.4％(146/158)、90.3％(112/124)及66.1％(146/221)。結(jié)論：乳腺鈣化在診斷不同乳腺疾病及鑒別良惡性腫瘤中具有重要作用。乳腺癌鈣化主要表現(xiàn)為病灶內(nèi)的、簇狀的、微小鈣化。
　　第二部分鈣化型乳腺癌基于SELDI-TOF-Ms技術(shù)的血清診斷模型的建立
　　目的：建立蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)平臺(tái)，尋找與乳腺癌，尤其是鈣化型乳腺癌相關(guān)差異蛋白質(zhì)，建立血清蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型，并

12、進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。
　　方法：入組乳腺癌病例72例，其中鈣化型乳腺癌組40例、無(wú)鈣化乳腺癌組32例，入組良性病變54例，其中良性鈣化組33例、良性無(wú)鈣化組21例。對(duì)入組病例術(shù)前血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，以弱陽(yáng)離子交換蛋白質(zhì)芯片(CM10)為檢測(cè)介質(zhì)，經(jīng)SELDI-TOF-MS測(cè)定，得到蛋白質(zhì)指紋圖譜并運(yùn)用BioMarker Wizard軟件分析比較，篩選差異蛋白，建立診斷模型。對(duì)所建立的診斷預(yù)測(cè)模型進(jìn)行盲法驗(yàn)證以分析評(píng)估。
　　結(jié)果：

13、
　　1.經(jīng)CM10芯片檢測(cè)出乳腺癌患者血清蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(M/Z)一般在1500～50000范圍內(nèi)。同一芯片內(nèi)蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度的變異系數(shù)(CV)值為0.161，M/Z的CV值為0.0004。不同芯片間蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度的CV值為0.16，M/Z的CV值為1.6×10-8。
　　2.與病灶良惡性相關(guān)的差異蛋白及由此建立的診斷模型：
　　(1)乳腺癌組與良性病變組比較，得到54個(gè)差異蛋白峰，其中19個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，在

14、乳腺癌組表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有7個(gè)，按M/Z由小到大的蛋白質(zhì)峰分別為8099、16204、16287、16465、16672、33123、40650，下調(diào)的有12個(gè)，分別為1746、1765、1771、1794、1842、1867、1888、1913、1934、1973、2025、9085。由M/Z分別為16465、15633、7890、9561、4396的5個(gè)差異蛋白峰建立診斷模型I，其敏感性為94.3％，特異性為97.6％。盲法驗(yàn)證結(jié)果

15、敏感性為86.8％，特異性為85.7％。
　　(2)鈣化型乳腺癌組與良性鈣化組比較，得到61個(gè)差異蛋白峰，其中16個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有6個(gè)，按M/Z由小到大的蛋白質(zhì)峰分別為5987、9450、15633、16287、16465、33068，下調(diào)的有10個(gè)，分別為1842、1867、1890、1899、1913、1934、1954、1980、2025、3000。由M/Z分別為16465、9561、179

16、2的3個(gè)差異蛋白峰建立診斷模型Ⅱ，其敏感性為89.3％，特異性為100％。盲法驗(yàn)證結(jié)果敏感性為100％，特異性為75.0％。
　　3.與病灶鈣化相關(guān)的差異蛋白：
　　(1)鈣化型乳腺癌組與無(wú)鈣化乳腺癌組血清蛋白質(zhì)峰比較，得到54個(gè)差異蛋白峰，其中14個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，在鈣化型乳腺癌組表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有1個(gè)，為3358，下調(diào)的有13個(gè)，按M/Z由小到大的蛋白質(zhì)峰分別為1746、1765、1771、1794、104

17、48、14320、14427、15445、15633、16204、24142、2881.1、29008。
　　(2)良性鈣化組與良性無(wú)鈣化組血清蛋白質(zhì)峰比較，得到60個(gè)差異蛋白峰，其中14個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，在良性鈣化組表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有3個(gè)，按M/Z由小到大的蛋白質(zhì)峰分別為3140、3358、6938，下調(diào)的有11個(gè)，分別為4704、5992、9452、10448、11943、15446、15658、24105、28

18、811、29009、38365。
　　結(jié)論：運(yùn)用SELDI-TOF-MS技術(shù)所建立的血清蛋白指紋圖譜模型在診斷乳腺癌尤其是鈣化型乳腺癌中具有非常高的敏感性與特異性，可望成為很好的診斷工具。有關(guān)鈣化的差異蛋白的研究對(duì)乳腺癌鈣化機(jī)制的理解具有重要意義。
　　第三部分鈣化型乳腺癌血清比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　目的：本部分應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)等蛋白質(zhì)組學(xué)

19、技術(shù)，對(duì)鈣化型乳腺癌、無(wú)鈣化乳腺癌、良性鈣化組、良性無(wú)鈣化組患者血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選在乳腺癌的鈣化形成過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用的差異蛋白分子。
　　方法：選擇鈣化型乳腺癌、無(wú)鈣化乳腺癌、良性鈣化組、良性無(wú)鈣化組患者血清各10例，將同一組標(biāo)本混合后，去除高豐度蛋白(白蛋白和IgG)。應(yīng)用非線性pH3-10，長(zhǎng)18cm的IPG膠條和12％的SDS-PAG進(jìn)行雙向凝膠電泳分離總蛋白，每一組的混合樣本均在相同條件下分別進(jìn)行3次

20、雙向電泳以保證重復(fù)性。用Image Master軟件對(duì)四組的血清蛋白質(zhì)組表達(dá)譜進(jìn)行差異分析，篩選差異3倍及以上且出現(xiàn)頻率大于或等于50％的蛋白點(diǎn)，將蛋白膠內(nèi)酶解后的肽段用MALDI-TOF-MS分析，獲得差異蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜，數(shù)據(jù)送入NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)MASCOT搜索引擎檢索。
　　結(jié)果：各組檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)如下：鈣化型乳腺癌組345±129個(gè)，無(wú)鈣化乳腺癌組329±40個(gè)，良性鈣化組296±27個(gè)，良性無(wú)鈣化組308

21、±43個(gè)。篩選出差異蛋白點(diǎn)31個(gè)。從相應(yīng)的銀染膠中挖取差異較大、蛋白斑點(diǎn)較濃、分離較清晰的蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，酶解后的肽段用MALDI-TOF-MS分析，所有差異蛋白點(diǎn)均得到鑒定。兩兩比較結(jié)果如下：①鈣化型乳腺癌與良性鈣化組比較：鈣化型乳腺癌組血清中特異性的蛋白質(zhì)2種，上調(diào)的蛋白質(zhì)8種，下調(diào)的蛋白質(zhì)7種；②鈣化型乳腺癌與無(wú)鈣化乳腺癌比較：鈣化型乳腺癌組血清中特異性的蛋白質(zhì)3種，上調(diào)的蛋白質(zhì)5種，下調(diào)的蛋白質(zhì)3種；③良性鈣化與良性無(wú)鈣化組

22、比較：良性鈣化組中血清中上調(diào)的蛋白質(zhì)1種，下調(diào)的蛋白質(zhì)4種。
　　結(jié)論：從查閱文獻(xiàn)看本研究鑒定出的部分分子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及機(jī)體代謝過(guò)程，從這些分子的生物學(xué)功能，推測(cè)這些蛋白可能與乳腺癌鈣化的形成相關(guān)，為闡明乳腺癌鈣化機(jī)理提供了一條新途徑。
　　第四部分觸珠蛋白作為差異蛋白的表達(dá)驗(yàn)證及其N-聚糖糖鏈特征研究
　　目的：對(duì)與乳腺癌鈣化相關(guān)的差異蛋白觸珠蛋白(haptoglobin，HP)進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，推測(cè)HP的N-糖鏈

23、結(jié)構(gòu)。
　　方法：收集鈣化型乳腺癌、無(wú)鈣化乳腺癌、良性鈣化組、良性無(wú)鈣化組患者血清各10例，通過(guò)免疫比濁法測(cè)定HP的蛋白含量；用免疫印跡驗(yàn)證各組HP的蛋白表達(dá)水平。分別再利用2-DE與Pro-Q Emerald488糖蛋白染料和SYPRO Ruby相結(jié)合的復(fù)合蛋白質(zhì)組學(xué)(MP)技術(shù)，進(jìn)一步研究HP這一類糖蛋白，利用Image master6.0軟件計(jì)算各自的蛋白灰度vol％值；應(yīng)用抗體免疫沉淀純化HP，并應(yīng)用western blo

24、t輔以幾種常見的凝集素印跡，驗(yàn)證HP一類蛋白的凝集素結(jié)合特性，并推斷其可能的糖鏈結(jié)構(gòu)特征。
　　結(jié)果：免疫比濁法測(cè)HP的總含量(包括α和β鏈)變化趨勢(shì)同2-DE結(jié)果一致。免疫印跡驗(yàn)證HP的β鏈表達(dá)同2-DE結(jié)果大致相同，均是鈣化型乳腺癌組HP總含量多于無(wú)鈣化乳腺癌組，且多于良性鈣化組，但免疫印跡驗(yàn)證時(shí)良性鈣化組HP總含量少于良性無(wú)鈣化組。488糖蛋白染色和SYPRO Ruby總蛋白染色結(jié)果比對(duì)，發(fā)現(xiàn)HP-α2和HP的蛋白質(zhì)表達(dá)水平

25、的變化與其糖基化程度的變化一致，preprohaptoglobin的蛋白表達(dá)水平變化與其糖基化程度的變化不一致；HP多抗抗體免疫沉淀純化HP-β鏈，不同的凝集素親和印跡法對(duì)HP-B鏈進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)推斷，HP-β鏈在鈣化型乳腺癌和無(wú)鈣化乳腺癌中對(duì)AAL和LCA的親和力較強(qiáng)，其中在鈣化型乳腺癌組對(duì)AAL和LCA的親和力比無(wú)鈣化乳腺癌組高，HP-β鏈在鈣化型乳腺癌中對(duì)PHA-E和RCA-I的親和力較強(qiáng)，以上幾種凝集素在良性鈣化組、良性無(wú)鈣化組中

26、幾乎無(wú)親和力，DSA和Con A在四組樣本中均無(wú)親和力。
　　結(jié)論：驗(yàn)證了HP在鈣化型乳腺癌、無(wú)鈣化乳腺癌、良性鈣化、良性無(wú)鈣化病例中蛋白表達(dá)水平。推測(cè)HP-B鏈在人不同血清樣本中糖修飾譜的結(jié)構(gòu)變化，它們也可能是影響乳腺癌鈣化發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)重要因素。HP含有末端、核心巖藻糖型和及末端半乳糖型糖鏈結(jié)構(gòu)形式，惡性鈣化的發(fā)生伴隨著HP的核心和末端巖藻糖型糖基化程度的改變。
　　結(jié)論
　　1.乳腺鈣化在診斷不同乳腺疾病及鑒別

27、良惡性腫瘤中具有重要作用。乳腺癌鈣化主要表現(xiàn)為病灶內(nèi)的、簇狀的、微小鈣化。臨床工作中迫切需要更多敏感、特異的腫瘤標(biāo)志物來(lái)提高乳腺鈣化型病變術(shù)前診斷的準(zhǔn)確性。
　　2.SELDI蛋白芯片技術(shù)具有快速、操作簡(jiǎn)便、樣品用量少和高通量等特點(diǎn)，運(yùn)用SELDI-TOF-MS技術(shù)所建立的血清蛋白指紋圖譜模型在診斷乳腺癌尤其是鈣化型乳腺癌中具有非常高的敏感性與特異性，可望成為很好的診斷工具。有關(guān)鈣化的差異蛋白的研究對(duì)乳腺癌鈣化機(jī)制的理解具有重要意

28、義。
　　3.運(yùn)用2-DE和MELDI-TOF-MS技術(shù)在鈣化型乳腺癌、無(wú)鈣化乳腺癌、良性鈣化組、正常無(wú)鈣化組四組血清樣本中鑒定出了31種差異蛋白。分析所鑒定出的蛋白，HP是其中之一，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及鈣磷代謝過(guò)程。
　　4.通過(guò)對(duì)HP的表達(dá)驗(yàn)證，我們推測(cè)HP家族可作為鈣化型乳腺癌的潛在血清標(biāo)記物，可能與乳腺癌特征性鈣化的形成相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。應(yīng)用MP技術(shù)結(jié)合2-DE顯示血清糖蛋白表達(dá)譜，免疫沉淀和凝集素印跡研究HP

29、N-糖基化修飾，推測(cè)鈣化型乳腺癌其糖鏈結(jié)構(gòu)除異常核心巖藻糖基化外，還伴隨著其他糖鏈結(jié)構(gòu)改變。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.首次從血清蛋白質(zhì)組學(xué)角度建立鈣化型乳腺癌術(shù)前血清蛋白質(zhì)指紋圖譜；
　　2.首次從血清蛋白質(zhì)組學(xué)角度建立鈣化型乳腺癌的診斷模型；
　　3.首次應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析并鑒定了鈣化型乳腺癌的血清差異蛋白譜。篩檢出的差異蛋白質(zhì)分子可以作為潛在的、有應(yīng)用價(jià)值的測(cè)定鈣化型乳腺癌的標(biāo)志物。為今后研究乳腺癌鈣化形