BMP-2調(diào)控EMT促進伴微鈣化乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、目的：鉬靶 X線上微鈣化表現(xiàn)，經(jīng)常是提示腫瘤惡性的征象，然而具體機制不詳。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)是TGF-β超家族的重要成員之一，可促進骨、軟骨生成，調(diào)控細胞增殖和分化，及調(diào)節(jié)多種臟器生長發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)BMPs與異位鈣化密切相關(guān)，且BMP-2在多種腫瘤有異常表達。本文旨在研究BMP-2在伴微鈣化乳腺癌中的表達及與臨床病理學特征、預后之間的關(guān)系，探究其對乳腺癌的影響及調(diào)控機制

2、。
　　方法：
　　1.收集天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院529例伴微鈣化病例，分析微鈣化與患者臨床病理學特征及預后的關(guān)系。并從中選取100例患者，切蠟塊進行免疫組化分析，了解其中BMP-2、Runx2、OPN的表達情況，分析BMP-2與預后的關(guān)系。
　　2.體外實驗驗證 BMP-2與乳腺癌細胞生物學行為的關(guān)系。選出低表達 BMP-2的細胞系 MCF-7，以及高表達 BMP-2的細胞系 MBA-MD-231，分別通過加rhBMP

3、-2刺激BMP-2表達，以及加入BMP-2抑制劑Noggin來抑制BMP-2的表達，應(yīng)用 MTT檢測 BMP-2對腫瘤細胞增殖的影響，應(yīng)用平板克隆實驗檢測BMP-2對細胞克隆形成能力的影響，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測BMP-2對細胞凋亡的影響，應(yīng)用劃痕試驗和Transwell實驗檢測BMP-2對侵襲遷徙能力的影響。
　　3.我們對BMP-2調(diào)控乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制進行研究，首先利用real-time PCR和Western blot等

4、技術(shù)分析細胞系中BMP-2與EMT相關(guān)指標的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控EMT的可能，為探究其調(diào)控EMT的可能機制，我們應(yīng)用real-time PCR和Western blot等技術(shù)在乳腺癌細胞系驗證BMP-2與PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的關(guān)系。以及加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，BMP-2對EMT的調(diào)控是否受到抑制來進一步驗證其可能的作用通路。
　　4.建乳腺癌移植瘤模型，觀察BMP-2對移植瘤的生長、轉(zhuǎn)移等情況的影響，

5、并應(yīng)用real-time PCR技術(shù)和免疫組化方法檢測移植瘤中EMT相關(guān)蛋白表達的變化。結(jié)果：1.伴微鈣化乳腺癌患者腫瘤較大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，并且無進展生存相對較差，伴微鈣化為影響預后的獨立因素之一。在伴微鈣化乳腺癌組織中， BMP-2、Runx2、OPN表達明顯增高，提示三者可能參與微鈣化形成，異位骨形成可能為微鈣化形成的機制之一。BMP-2高表達與患者無進展生存明顯相關(guān)，為獨立預后因素之一。
　　2.外源性rhBMP-2可促

6、進人乳腺癌細胞MCF-7中BMP-2的表達。而BMP-2抑制劑Noggin可以抑制MBA-MD-231細胞中BMP-2表達。體外實驗結(jié)果顯示， rhBMP-2可促進乳腺癌細胞增殖、克隆形成以及遷移侵襲能力，并且可使凋亡能力下降。而Noggin可抑制BMP-2的作用，從而抑制腫瘤增殖、克隆形成，抑制乳腺癌細胞侵襲遷移能力，并且可以促進凋亡。提示BMP-2可促進乳腺癌細胞惡性程度。
　　3.在乳腺癌 MCF-7細胞中，BMP-2的表達

7、與 EMT一些指標顯著相關(guān)。隨著BMP-2濃度增加，上皮表型 E-cadherin、Cx43表達顯著下調(diào)，而間質(zhì)表型N-cadherin、FN、Vimentin mRNA表達水平顯著上調(diào)。BMP-2可促進PI3K/Akt信號通路p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達，進而調(diào)控EMT進程。而加入此信號通路抑制劑 LY294002后，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR未出現(xiàn)明顯的上調(diào)，EMT相關(guān)指標無明顯改變，BMP-2調(diào)控EMT的

8、作用明顯減弱。可見BMP-2可以通過激活PI3K/Akt信號通路促進MCF-7細胞發(fā)生EMT，從而誘導腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。
　　4.應(yīng)用經(jīng)BMP-2處理過的乳腺癌MCF-7細胞成功建立BMP-2高表達移植瘤模型。BMP-2組移植瘤增長速度明顯快于對照組。BMP-2組出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及骨轉(zhuǎn)移的比例明顯大于對照組。與對照組相比，BMP-2組E-cadherin表達減弱， Vimentin表達增強，提示出現(xiàn)EMT現(xiàn)象。體內(nèi)實驗進一步驗證BMP

9、-2可促進EMT進程，調(diào)控乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：
　　1.乳腺癌伴微鈣化這一特征與腫瘤惡性度密切相關(guān)。
　　2. BMP-2高表達于伴微鈣化乳腺癌中，且與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是預后不良的指標。
　　3.經(jīng)BMP-2刺激后乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移能力增強，惡性度提高。
　　4. BMP-2可誘導PI3K/Akt通路關(guān)鍵蛋白磷酸化，調(diào)控EMT相關(guān)指標變化，誘導EMT進程，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　5.體內(nèi)實驗證實 BM