利用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測乳腺癌患者血清蛋白指紋圖譜并建立乳腺癌診斷模型.pdf

1、目的:利用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALD-TOFMS)技術(shù)檢測血清樣本蛋白多肽表達圖譜,分析clinprot實驗方法的重復(fù)性及血清不同的凍融次數(shù)對實驗結(jié)果的影響,以便建立MALDI-TOF MS檢測方法用于后續(xù)試驗;同時比較分析弱陽離子交換磁珠(MB-WCX)、銅離子螯合磁

2、珠(MB-IMAC Cu)、疏水C8磁珠(MB-HIC C8)進行血清蛋白多肽分離富集后圖譜采集的差異,選取分離蛋白質(zhì)能力強的MB-WCX對乳腺癌及健康對照組的血清樣本進行檢測,通過高通量分析軟件進行數(shù)據(jù)處理,篩選出乳腺癌和健康對照組之間的差異蛋白多肽質(zhì)荷比峰,并建立乳腺癌診斷模型,進行模型驗證確定診斷模型具有高度靈敏度和特異度,為臨床尋找乳腺癌血清腫瘤標志物提供理論依據(jù)。
　　 方法:1采用MB-WCX分別對凍融1、3、5次后

3、的血清樣本分離提純,經(jīng)MALDI-TOF MS檢測后比較其蛋白質(zhì)圖譜,以此判斷凍融次數(shù)對實驗結(jié)果的影響。
　　 2采用MB-WCX進行血清樣本蛋白分離提純,經(jīng)MALDI-TOF MS檢測后,選擇不同分子量范圍的9個蛋白重復(fù)測定,比較組間和組內(nèi)變異系數(shù)以考察重復(fù)性。
　　 3比較MB-WCX、MB-IMAC Cu、MB-HIC C8的平均出峰量、平均峰面積和平均峰強度等參數(shù),從而選取分離蛋白質(zhì)能力較好的一種磁珠用于大量血清

4、樣本的提純。
　　 4選擇分離蛋白質(zhì)能力較好的MB-WCX對乳腺癌及健康對照組的血清樣本進行檢測,然后用MALDI-TOF MS檢測不同組患者蛋白質(zhì)譜圖并加以對比分析。研究過程中儀器操作、數(shù)據(jù)分析和圖像采集分別用flexControlMS3.0、ClinProToolsTM2.1和flexAnalysis3.0軟件。對所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白計算識別率、預(yù)測能力和驗證準確率,或差異蛋白組合后診斷的效果,以指導(dǎo)臨床應(yīng)用。
　　 結(jié)

5、果:1研究發(fā)現(xiàn),樣品的凍融次數(shù)在3次以內(nèi)不影響質(zhì)譜峰的采集,沒有顯著性差異(P＞0.05),凍融次數(shù)越多,對小分子量蛋白或多肽的影響越大。
　　 2重復(fù)性研究表明,標準品變異系數(shù)范圍在10.67％～29.59％,混合樣品變異系數(shù)范圍在9.88％～30.07％,重復(fù)性很好。
　　 3相同樣本利用MB-WCX處理后的平均出峰量和平均峰面積均明顯優(yōu)于MB-IMAC-Cu、MB-HIC C8(P＜0.05)。
　　 4應(yīng)

6、用MB-WCX與MALDI-TOF MS檢測到15個明顯差異表達的蛋白質(zhì)峰,分子量分別為4964.52Da、7765.28Da、3261.95Da、1621.2Da、3192.55Da、7008.09Da、2288.99Da、1741.74Da、3225.04Da、4363.01Da、6910.35Da、7631.46Da、3935.34Da、8140.66Da、4054.5Da。
　　 5分子量分別為4964.52Da和776

7、5.28Da的2個蛋白質(zhì)峰的差異最顯著,在乳腺癌患者中的表達上調(diào),有可能成為潛在的乳腺癌早期診斷標志物。
　　 6利用差異蛋白質(zhì)峰建立乳腺癌診斷模型后應(yīng)用QC(快速分類算法)、GA(遺傳算法)和SNN(神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法)對模型進行驗證,得到該模型區(qū)分乳腺癌患者和健康者的靈敏度和特異度均高于80％。
　　 結(jié)論:1 MALDI-TOF MS作為一種高靈敏度的研究平臺,嚴格操作規(guī)程減少凍融次數(shù)能夠減少變異,提高檢測結(jié)果的重復(fù)性和