結直腸癌發(fā)生和肝轉移相關蛋白質差異表達及其意義的研究.pdf

1、目的： 結直腸癌肝轉移是影響結直腸癌預后的重要因素，25％的結直腸癌患者確診時即伴隨肝轉移，另有25％患者在結直腸癌根治術后伴隨肝轉移。結直腸癌肝轉移的早期診斷治療對延長患者生命至關重要。為了深入研究結直腸癌發(fā)生、發(fā)展及肝轉移的分子機理，以提高對結直腸癌肝轉移的防治效果，我們采用蛋白質組學、細胞生物學及免疫組織化學研究方法，對結直腸癌原發(fā)灶和肝轉移灶及不同分期的結直腸癌組織進行實驗研究，為揭示結直腸癌肝轉移機制及篩選臨床腫瘤標志

2、物和治療靶標提供依據(jù)。 材料和方法：標本采集實驗所用標本均取自北京軍區(qū)總醫(yī)院普通外科，選取經(jīng)臨床影像學診斷為結直腸癌伴隨肝轉移患者共16例，術中切取適量的結直腸癌原發(fā)灶、肝轉移灶和癌旁正常腸粘膜標本，立即貯于液氮中凍存?zhèn)溆?。所選標本術后病理證實為結直腸中低分化腺癌并伴隨肝轉移，臨床TNM分期Ⅳ期(T2-4N1-2M1)。其中男9例女7例。年齡41-75歲。其中結腸癌8例，腹膜反折外直腸癌8例。 蛋白質樣品制備及雙向凝膠電

3、泳雙向熒光差異凝膠電泳(2-DDIGE)按照GEHealthcare提供的EttanDIGE使用手冊操作方法進行。將每例患者的各種樣品等量混和作為內標(Cy2標記)，然后將各樣品50μg分別與CyDyeDIGE最小標記法染料(Cy3、Cy5)400pmol混和上樣。將樣品加入IPG膠條槽內并放置好24cmIPG膠條。使用等電聚焦儀PROTEANIEFCell(Bio-Rad)進行第一向等電聚焦電泳(IEF)；使用EttanDALTTwe

4、lve電泳系統(tǒng)(Amersham)進行蛋白樣品的二向分離。電泳結束后室溫下在避光容器中將凝膠存放于SDS電泳緩沖液中，立即對凝膠進行掃描。 圖像采集與分析用Fyphoon9410掃描儀在488/520nm，532/580nm，633/670nm波長分別對Cy2，Cy3，Cy5熒光染料標記的圖像進行掃描，用DeCyderv.5.02圖像分析軟件對DIGE圖像進行分析和差異點尋找。計算各塊膠與MASTER膠的匹配率，差異點滿足條件：

5、p≤0.05。 質譜分析及質譜數(shù)據(jù)庫搜尋使用液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質譜(LC-ESI-MS/MS)及MALDI-TOF-MS質譜儀對膠上消化后的差異蛋白點進行質譜分析。獲得的肽序列信息(PSD)及肽質量指紋譜(PMF)數(shù)據(jù)用Mascot軟件在SWISSPORT數(shù)據(jù)庫中搜尋鑒定蛋白質。 細胞生物學實驗用常規(guī)RT-PCR方法克隆差異表達蛋白基因全長cDNA。構建真核表達載體pcDNA3.1-CAⅡ。采用脂質體轉染法將pcDN

6、A3.1-CAⅡ轉染人直腸腺癌HR-8348細胞。四唑鹽(MTT)比色試驗：以轉染pcDNA3.1-CAⅡ的細胞為實驗組；以未轉染pcDNA3.1-CAⅡ的細胞為對照組。分別觀察5-Fu及奧沙利鉑藥物對其的抑制率。抑制率=[1-(實驗組吸光度值/空白對照組吸光度值)]×100％。 免疫組織化學實驗用常規(guī)免疫組織化學方法驗證人精氨酸酶在結直腸癌不同分期各種組織中的表達情況。使用美國ZYMED公司SP試劑盒在組織石蠟切片上進行免疫染

7、色。 結果： 雙向凝膠電泳及質譜鑒定在16個病例組結直腸癌原發(fā)灶、肝轉移灶及正常腸粘膜組織標本的2-DDIGE中，蛋白點清晰可辨，每塊膠獲得蛋白點約為900個。結直腸癌原發(fā)灶與肝轉移灶蛋白質組分有明顯差別。用DeCyderv.5.02圖像分析軟件對DIGE圖像進行分析和差異點尋找。我們選擇了22個差異蛋白點進行了質譜鑒定。鑒定出有意義的蛋白質20種。2種蛋白在各種癌組織中低表達而在正常腸粘膜中高表達，分別為碳酸酐酶Ⅱ(C

8、AⅡ)和蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)；2種蛋白在結直腸癌原發(fā)灶組織中表達上調而在肝轉移灶中表達下調，分別為激活蛋白因子2B，腺苷蛋氨酸變異體；16種蛋白在肝轉移灶組織中表達上調，包括鋅指蛋白64同系物，鳥嘌呤核苷酸交換因子4，人精氨酸酶，人谷胱甘肽S-轉移酶A3，腫瘤壞死因子α-誘導蛋白9，谷氨酸脫氫酶載脂蛋白鏈A，轉接分子受體2，核苷酸還原酶M2多肽等。 細胞生物學實驗轉染CAⅡ基因的直腸腺癌細胞HR8348對奧沙利鉑和5-F

9、u化療藥物更敏感，耐藥性更低。 免疫組化驗證人精氨酸酶定位結直腸癌組織細胞質中，人精氨酸酶在正常腸粘膜、無淋巴結轉移的結直腸癌原發(fā)灶組織、有淋巴結轉移的直腸癌原發(fā)灶組織、有肝轉移的直腸癌原發(fā)灶組織、肝轉移灶組織中的陽性表達率逐步增高。特別是在伴淋巴結轉移的結直腸癌和肝轉移灶組織中的表達陽性率顯著高于無淋巴結轉移的結直腸癌原發(fā)灶組織及正常腸粘膜。 結論： 應用差異蛋白質組學方法研究結直腸癌發(fā)生過程中蛋白質組的改變，

10、，是篩選結直腸癌腫瘤標志物及探討結直腸癌發(fā)生及轉移機制的有效手段。雙向熒光差異凝膠電泳(2-DDIGE)作為近幾年廣泛應用的蛋白質組學新技術也開始應用于結直腸癌的研究，其精確度和可重復性都大大超過常規(guī)方法。本實驗應用雙向熒光差異凝膠電泳方法，對結直腸癌原發(fā)灶、肝轉移灶及癌旁正常腸粘膜三種組織進行差異蛋白質組學研究，發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)、蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)在癌組織和復發(fā)轉移灶中表達顯著下調；發(fā)現(xiàn)激活蛋白因子2B(activa

11、torprotein2B)和腺苷蛋氨酸變異體(transgelinvariant)在結直腸癌原發(fā)灶組織中表達顯著增高。發(fā)現(xiàn)人精氨酸酶(Homosapiensarginase)、谷胱甘肽轉移酶A3(GSTA3)、鳥嘌呤核苷酸交換因子4(ASEF)等在肝轉移灶組織中表達顯著增高； 轉染CAⅡ基因的直腸腺癌細胞HR8348增強了奧沙利鉑和氟尿嘧啶(5-Fu)對該細胞的細胞毒作用，使癌細胞對化療藥物更敏感，耐藥性更低，提示癌組織中CAⅡ

12、表達與癌組織的侵襲、轉移和生物學行為有關,CAⅡ在抑制結直腸癌發(fā)生、轉移中發(fā)揮作用，為腫瘤的基因診斷及基因治療奠定了理論基礎。 免疫組織化學方法檢測結直腸癌不同階段各種組織發(fā)現(xiàn)，人精氨酸酶在伴淋巴結轉移的結直腸癌原發(fā)灶和肝轉移灶組織中的表達陽性率顯著高于無淋巴結轉移的結直腸癌原發(fā)灶組織和正常腸粘膜組織。人精氨酸酶的高表達不僅與結直腸癌的發(fā)生相關，在結直腸癌的發(fā)展轉移，特別是淋巴結轉移、肝轉移中發(fā)揮重要作用。人精氨酸酶可能成為結直

13、腸癌淋巴結轉移、肝轉移、預后評估的候選蛋白標志物。 本文對結直腸癌肝轉移做了初步的差異蛋白質組學研究，獲得了一些差異蛋白，這些蛋白將是我們進一步研究結直腸癌肝轉移機理的突破口，更深入的研究這些蛋白質在腫瘤的發(fā)生及轉移過程中的作用，對揭示肝轉移發(fā)生的機制和發(fā)現(xiàn)新的有意義的腫瘤標志物有一定的意義。本研究發(fā)現(xiàn)人精氨酸酶可能成為預測結直腸癌肝轉移的標志物，但尚需要大樣本多中心的臨床實驗進一步驗證。相信，隨著結直腸癌肝轉移蛋白質組學研究的