FasL相互作用蛋白在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用及其意義.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是我國常見的惡性腫瘤之一，在消化道腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均位居第二位。隨著我國國民總體生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)的變化，近年結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，雖結(jié)直腸癌診療技術(shù)有著長足發(fā)展，但結(jié)直腸癌的總體5年存活率并無顯著提高，其原因是術(shù)后復(fù)發(fā)與肝轉(zhuǎn)移，也是制約結(jié)直腸癌預(yù)后的主要因素。因此如何早期預(yù)測、早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷與早期治療結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)與肝轉(zhuǎn)移，是提高5年生存率的關(guān)鍵。因此深入研

2、究結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的機(jī)理，具有十分重要的臨床意義。尋找新的、特異性強(qiáng)、敏感性高的診斷復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，是本研究的立題依據(jù)和主要目的。 目的：利用酵母雙雜交系統(tǒng)，在人胎肝文庫中篩選并驗(yàn)證FasL相互作用蛋白；通過在篩選建立的結(jié)直腸癌高肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型組織及細(xì)胞株中驗(yàn)證其表達(dá)規(guī)律，探討FasL及其相互作用蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和在肝轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，為篩選結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷分子標(biāo)志物提供理論依據(jù)。 方法：擴(kuò)增誘鉺蛋

3、白質(zhì)粒FasL-pGBKT7，應(yīng)用Western'Blot驗(yàn)證其在酵母AH109細(xì)胞中表達(dá)FasL蛋白。將FasL-pGBKT7質(zhì)粒和人胎肝cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞。通過高嚴(yán)格性篩選，在人胎肝cDNA文庫中篩選并鑒定與FasL相互作用的蛋白；通過篩選得到的結(jié)直腸癌高肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，比較高轉(zhuǎn)移細(xì)胞COLR-1細(xì)胞與人直腸癌HR-8348細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞學(xué)特性；用免疫組織化學(xué)方法檢測FasL及相互作用蛋白在裸鼠組織標(biāo)本中表達(dá)情

4、況，比較在有無肝轉(zhuǎn)移組織中這些蛋白的表達(dá)差異，證實(shí)他們?cè)诮Y(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：FasL-pGBKT7在酵母細(xì)胞中沒有自身激活活性，并可以穩(wěn)定表達(dá)FasL蛋白。通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出4個(gè)與FasL特異性相互作用的蛋白，包括金屬硫蛋白1K、1G，組織蛋白酶B，Anchor Attachment蛋白。用皮下瘤結(jié)直腸原位移植模型及肝轉(zhuǎn)移灶組織塊原代培養(yǎng)的方法，篩選

5、出了具有肝轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞系COLR-1細(xì)胞，并比較了COLR-1細(xì)胞與結(jié)直腸癌HR-8348細(xì)胞的生長特性，體外培養(yǎng)顯示COLR-1細(xì)胞腫瘤細(xì)胞學(xué)特性更加明顯。流式細(xì)胞儀檢測COLR-1細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯高于結(jié)直腸癌HR-8348細(xì)胞。應(yīng)用免疫組化方法對(duì)COLR-1細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：組織蛋白酶B在具有高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)(82.35％)，高于未轉(zhuǎn)移組(27.27％)；而FasL在二組中均高表

6、達(dá)。應(yīng)用蛋白印跡檢測進(jìn)一步證明FasL及組織蛋白酶B均可在COLR-1細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證了FasL相互作用蛋白結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。從本實(shí)驗(yàn)中我們獲得的FasL相互作用的四種蛋白在腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移機(jī)制中均具有重要的研究價(jià)值，尤其是組織蛋白酶B和Anchor Attachmcnt蛋白更為重要，其中組織蛋白酶B在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的研究較為突出，而Anchor Attachment蛋白在結(jié)直腸癌的研究領(lǐng)