人大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)組分析與鑒定.pdf

1、惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，但迄今為止，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究尚未獲得突破性進(jìn)展。篩選和鑒定在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用的關(guān)鍵分子，尋找早期診斷的生物標(biāo)志物和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物靶點(diǎn)，闡明腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，是當(dāng)前腫瘤轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)。 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，腫瘤轉(zhuǎn)移的全過(guò)程受以下幾個(gè)因素的調(diào)控：1、在轉(zhuǎn)移啟動(dòng)初期E-cadherin、Ig超家族、選擇素、整合素等參與腫瘤細(xì)胞間的脫落以及腫瘤細(xì)胞與胞外基質(zhì)的粘附

2、；2、腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞分泌的蛋白水解酶及其抑制劑，在降解胞外基質(zhì)和血管的基底膜過(guò)程中發(fā)揮重要作用；3、在運(yùn)動(dòng)因子、生長(zhǎng)因子、歸巢因子等的作用下，腫瘤細(xì)胞遷移到轉(zhuǎn)移靶器官；4、血管增生因子VEGF、bFGF、IL-8、PDGF等促進(jìn)新生血管的形成，伴隨著腫瘤細(xì)胞的增生，形成新的轉(zhuǎn)移灶，完成轉(zhuǎn)移過(guò)程。鑒于目前對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究往往針對(duì)單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)分子以及關(guān)注基因水平的改變，缺乏系統(tǒng)性和綜合性的分析，因此在所有這些調(diào)控因素中，究竟哪些分

3、子在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，仍有待闡明。近年來(lái)開展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為揭示腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制帶來(lái)了新的希望。 本研究以人大腸癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用比較蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定了11個(gè)與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選蛋白，并探討了HSP27在大腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及其功能，具體研究結(jié)果如下： 1、人大腸癌細(xì)胞系蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)的建立及其優(yōu)化 優(yōu)化人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞系的蛋白質(zhì)樣品制備方法，建立人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞系的雙向凝膠電

4、泳(2-DE)圖譜，為識(shí)別鑒定結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。分別用磷酸鹽緩沖液和等滲蔗糖溶液沖洗細(xì)胞，胰酶消化或直接刮刀法收集細(xì)胞后提取總蛋白質(zhì)，利用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行分離，凝膠經(jīng)銀染顯色后，用PDQuest軟件分析2-DE圖譜。結(jié)果以等滲蔗糖緩沖液沖洗細(xì)胞并直接刮刀法所提取Lovo細(xì)胞總蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳，可獲得分辨率高、重復(fù)性好的人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞系2-DE圖譜。等滲蔗糖溶液有效的降低了鹽離子對(duì)等電聚焦的影響，聚

5、焦效果優(yōu)于磷酸鹽緩沖溶液處理組；皿上直接刮刀收集的方法避免引入胰酶及其對(duì)細(xì)胞的破壞，保證了細(xì)胞蛋白質(zhì)的完整性和代表性。我們實(shí)驗(yàn)表明以等滲蔗糖溶液沖洗細(xì)胞結(jié)合皿上直接裂解是一種較好的細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備方法，在此基礎(chǔ)上我們初步建立了分辨率較高且重復(fù)性好的人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞系蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜。 2、人大腸癌細(xì)胞株SW480和SW620的蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳分析 為了更好的理解大腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)理和尋找大腸癌預(yù)后的標(biāo)志

6、分子，我們運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)人大腸癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SW480和SW620細(xì)胞進(jìn)行了差異表達(dá)雙向凝膠電泳分析，數(shù)字化圖像分析發(fā)現(xiàn)有72個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在兩組凝膠中有顯著差異表達(dá)，在SW620細(xì)胞中表達(dá)量升高的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)有30個(gè)，在SW480細(xì)胞中表達(dá)量升高的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)有42個(gè)；定性差異表達(dá)分析(表達(dá)量相差10倍以上)發(fā)現(xiàn)22個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)僅在SW620中出現(xiàn)，而有27個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)只在SW480中檢測(cè)到，結(jié)合軟件分析和手工篩選，選取15個(gè)點(diǎn)

7、清晰且表達(dá)水平改變明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)作為質(zhì)譜鑒定的靶點(diǎn)。 3、雙向凝膠電泳差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定和驗(yàn)證 以大腸癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用2-DE分離技術(shù)結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定了11個(gè)與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，其中SW620細(xì)胞株表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有磷酸甘油酸變位酶1，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白和高遷移率族蛋白B-1，而熱休克蛋白27，膜聯(lián)蛋白I，甲硫腺苷磷酸化酶，切絲蛋白1和表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白在SW620中表達(dá)下調(diào)

8、。大多數(shù)差異蛋白功能涉及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、粘附、凋亡等過(guò)程，研究結(jié)果為闡明大腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及尋找預(yù)測(cè)大腸癌轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。 為保證蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定結(jié)果的可靠性，在蛋白和mRNA水平對(duì)候選蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。采用westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證結(jié)果表明HSP27和COF1在低轉(zhuǎn)移的SW480中高表達(dá)，且COF1僅在SW480中檢測(cè)到，蛋白質(zhì)水平的驗(yàn)證結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組的分析結(jié)果完全一致。此

9、外，采用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)編碼候選蛋白的mRNA水平檢測(cè)結(jié)果表明：編碼HMGB1和PBP的mRNA在高轉(zhuǎn)移的SW620中高表達(dá)，而編碼HSP27、ANXI、COF1和E-FABP的mRNA在SW480中高表達(dá)，所驗(yàn)證的編碼候選蛋白的mRNA水平驗(yàn)證結(jié)果與候選蛋白的蛋白質(zhì)組分析結(jié)果一致，說(shuō)明候選蛋白在大腸癌細(xì)胞株中的蛋白水平變化主要是由于基因的轉(zhuǎn)錄水平高低不同所致，也肯定了候選蛋白在高、低轉(zhuǎn)移株間的差異表達(dá)。結(jié)果表明通過(guò)蛋白質(zhì)組技術(shù)

10、篩選到的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白是可靠的。 4、熱休克蛋白27與大腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析 為更好的理解大腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)理和尋找可能的腫瘤預(yù)后標(biāo)記分子標(biāo)志物，我們用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)兩種不同轉(zhuǎn)移潛能的SW620和SW480細(xì)胞株的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27在高轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細(xì)胞中的低表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)一步驗(yàn)證和分析了該蛋白在SW620和SW480兩種細(xì)胞中的差異表達(dá)和定位。68例臨床大腸癌組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)

11、熱休克蛋白27的表達(dá)率與年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期無(wú)相關(guān)性(χ2test，p＞0.05)，但其過(guò)表達(dá)和大腸癌轉(zhuǎn)移顯著負(fù)相關(guān)(Fisher'sexacttest，p=0.035＜0.05)。結(jié)果表明，大腸癌細(xì)胞熱休克蛋白27的過(guò)表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為相關(guān)，可能在阻止其轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。 綜上所述，本研究應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組技術(shù)對(duì)人大腸癌SW620和SW480兩種不同轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株進(jìn)行了對(duì)比研究，獲得了11個(gè)差異