TrkB對結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、TrkB(tropomyosin-related kinase B)是Trk家族成員之一，Trk基因最初作為一種癌基因被克隆出來，在胞外區(qū)與tropomyosin基因融合，其酪氨酸激酶活性組成型活化，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的不斷增殖。后來發(fā)現(xiàn)原癌基因Trk是神經(jīng)生長因子(NGF)的高親和力受體，在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中細(xì)胞分化和程序性細(xì)胞死亡具有重要作用。TrkB是神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的受體，是一種受體酪氨酸激酶，在抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲

2、轉(zhuǎn)移方面起著非常重要的調(diào)控作用。TrkB在多種人類腫瘤中過表達(dá)，與細(xì)胞凋亡和侵襲等信號通路的異常有關(guān)，從而與惡性腫瘤的演進(jìn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。研究表明，TrkB表達(dá)上調(diào)可以通過形成多細(xì)胞團(tuán)并誘導(dǎo)細(xì)胞耐受脫壁誘導(dǎo)的凋亡，促進(jìn)肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，Sclabas GM等人也發(fā)現(xiàn)TrkB過表達(dá)導(dǎo)致其下游信號通路活化，介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移。TrkB過表達(dá)與Wilms’腫瘤患者死亡率的增加相關(guān)，并可以作為預(yù)測胃癌發(fā)生遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的指標(biāo)。因此

3、目前認(rèn)為TrkB對于惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。TrkB是一種營養(yǎng)神經(jīng)的酪氨酸激酶受體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其生物學(xué)功能。目前研究主要集中于生理或病理條件下，TrkB通過PI3K信號通路有效并特異的抑制與caspase相關(guān)的非惡性上皮細(xì)胞失巢凋亡。TrkB能夠誘導(dǎo)形成大細(xì)胞團(tuán)，使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下存活并增殖。在小鼠動物實驗中，這些細(xì)胞迅速形成浸潤淋巴管和血管的腫瘤，并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔器官。與TrkB抑制失巢凋亡的能力一致，轉(zhuǎn)移灶

4、內(nèi)（無論是小血管浸潤灶或大腫瘤結(jié)節(jié)）含有非常少的凋亡細(xì)胞。這些結(jié)果表明TrkB具有較強的促癌作用，以及特異的促存活功能，有助于腫瘤轉(zhuǎn)移，這可能是過表達(dá)TrkB的人類腫瘤具有侵襲性的原因。阻斷TrkB能夠抑制胚胎的發(fā)育和存活，體內(nèi)實驗也證實TrkB抑制劑可以阻斷早期胚胎發(fā)育并促進(jìn)胚泡凋亡。TrkB通過PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞的存活，抑制TrkB后導(dǎo)致人胚胎干細(xì)胞凋亡。然而，很多研究小組發(fā)現(xiàn)高侵襲力的腫瘤細(xì)胞中TrkB蛋白表達(dá)上

5、調(diào)。TrkB在多種腫瘤細(xì)胞中通過PI3K信號通路的活化，抑制細(xì)胞失巢凋亡，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，因此TrkB對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。研究表明TrkB也能夠活化其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤侵襲，TrkB通過JNK信號通路的活化，促進(jìn)星形細(xì)胞瘤生長，有助于腫瘤惡性轉(zhuǎn)化。在對結(jié)腸癌的研究中，Bardelli等人發(fā)現(xiàn)TrkB基因存在點突變，但目前還沒有TrkB在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)與ERK信號通路活化關(guān)系的相關(guān)報導(dǎo)。
　　TrkB與腫

6、瘤的關(guān)系正日益受到關(guān)注。盡管有報道發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中TrkB基因發(fā)生點突變，但其對于TrkB生物學(xué)功能的影響還不明確，而且目前還沒有關(guān)于TrkB在結(jié)腸癌組織中表達(dá)情況的文獻(xiàn)報道。本研究的目的在于探討60例手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織中TrkB蛋白表達(dá)及其臨床意義，比較TrkB在30例結(jié)腸癌和癌旁組織中表達(dá)水平的差異，并分析二者之間的關(guān)系。我們研究發(fā)現(xiàn)，TrkB在結(jié)腸癌組織中過表達(dá)，但目前TrkB是否通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡從而有助于結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移，以及Trk

7、B對于結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用還不明確。本研究同時探討30例手術(shù)切除的結(jié)腸癌癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TrkB的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系。我們在細(xì)胞水平上分別應(yīng)用特異性TrkB-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染及ERK特異性抑制劑處理SW620細(xì)胞，分別探討干擾TrkB蛋白表達(dá)和抑制ERK活化對細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲以及細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化水平的影響。我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)TrkB蛋白表達(dá)抑制ERK磷酸化，同時促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖和侵襲;阻斷ERK活化抑制SW

8、620細(xì)胞侵襲，但對細(xì)胞增殖和凋亡沒有影響。研究結(jié)果提示，TrkB可能通過ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強SW620細(xì)胞的侵襲能力，從而促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。TrkB可能通過其他信號通路影響SW620細(xì)胞的增殖和凋亡，但還有待于進(jìn)一步研究。
　　材料與方法:
　　結(jié)腸癌組織標(biāo)本:60例新鮮結(jié)腸癌標(biāo)本均來自遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科2006年3月至8月手術(shù)切除標(biāo)本?；颊咝g(shù)前均未接受過任何化學(xué)或放射治療。福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織切片常規(guī)進(jìn)

9、行HE染色，分別由兩名病理診斷醫(yī)師，根據(jù)2002年美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)結(jié)直腸癌分級系統(tǒng)，確定腫瘤的組織學(xué)分型。60例結(jié)腸腺癌包括:高分化癌28例，中分化癌24例，低分化癌8例;腫瘤直徑＜5cm者18例，≥5cm者42例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。
　　30例配對的結(jié)腸癌和癌旁組織（距離瘤緣≥5cm）來自遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科2006年3月至6月手術(shù)切除標(biāo)本。在液氮中快速冰凍，以后用于提取蛋白。常規(guī)病理檢查手術(shù)切除

10、淋巴結(jié)，確定結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。
　　轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)標(biāo)本:30例轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌癌旁淋巴結(jié)標(biāo)本均來自遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科2006年3月至11月手術(shù)切除標(biāo)本?；颊咝g(shù)前均未接受過任何化學(xué)或放射治療。福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織切片常規(guī)進(jìn)行HE染色，分別由兩名病理診斷醫(yī)師，根據(jù)2002年美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)結(jié)直腸癌分級系統(tǒng)，確定腫瘤的組織學(xué)分型。30例結(jié)腸腺癌包括:高分化癌11例，中分化癌13例，低分化癌6例;原發(fā)腫瘤直徑＜5cm者

11、10例，≥5cm者20例;。常規(guī)病理檢查手術(shù)切除淋巴結(jié)，確定結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍。
　　Western blot:向冰凍組織（包括結(jié)腸癌和癌旁組織）加入10倍體積的含有20mM Tris-HCl,1mM EDTA,50mM NaCl,50mM NaG1mM Na3VO4,1％Triton-X100和磷酸酶抑制劑(1mM PMSF)的組織裂解緩沖液，置于冰上勻漿;4℃下15000rpm離心30min，收集上清并保存于-70℃?zhèn)溆?

12、考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度;上樣總蛋白為80μ g，8％ SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5％脫脂奶粉封閉，兔抗人TrkB(1∶200)和兔抗人β-actin(1∶300)4℃孵育過夜;山羊抗兔IgG(1∶2000)37℃孵育2h;最后ECL發(fā)光。EC3 Imaging System(UVP Inc.，USA)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件用于半定量分析特異性條帶的灰度值。將目的蛋白與β-actin灰度比值作為相對表達(dá)量

13、。
　　免疫組化染色SP法:60張結(jié)腸癌組織切片常規(guī)脫蠟并水化。染色步驟簡述如下:0.1mol/L Tris-HCl(pH10.0)緩沖液，高溫高壓修復(fù)抗原2min;3％ H2O2和5％山羊血清37℃下分別孵育切片1h;兔抗人TrkB(1∶100)4℃孵育過夜;山羊抗兔IgG和SP復(fù)合物37℃分別孵育切片30min;最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。同時設(shè)立陽性和陰性對照。兩名病理診斷醫(yī)師分別對組織切片染色情況進(jìn)行評分。胞膜或胞漿

14、出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞。至少5個高倍視野下(×400)，評價TrkB染色強度（1=弱，2=強）和陽性腫瘤細(xì)胞百分比（0=陰性，1-50％=1，51-75％=2，≥76％=3）。上述兩項評分的乘積作為每個標(biāo)本染色的最終評分，最后確定結(jié)腸癌標(biāo)本的染色情況分別為陰性:0分;低表達(dá):評分≤3;或高表達(dá):評分＞3。
　　TUNEL染色:切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗5min，蛋白酶K室溫孵育切片15min。將50μl TdT與450μl熒光

15、素標(biāo)記的dUTP液混勻，制備TUNEL反應(yīng)混合液。玻片干后加50μl TUNEL反應(yīng)混合液，同時設(shè)立陽性和陰性對照，加蓋玻片在37℃濕盒中避光孵育1h。PBS洗3次，玻片干后加50μl converter-POD，加蓋玻片在37℃濕盒中避光孵育30min。PBS洗3次后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。最后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為凋亡細(xì)胞，200×鏡下隨機選取5個視野，觀察并計數(shù)凋亡細(xì)胞，細(xì)胞

16、凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/同一視野下細(xì)胞總數(shù)）×100％。
　　細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染:人高轉(zhuǎn)移SW620和低轉(zhuǎn)移SW480結(jié)腸腺癌細(xì)胞系均用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10％胎牛血清，100U/ml青、鏈霉素和NaHCO3，5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)時提取蛋白。細(xì)胞實驗均重復(fù)3次。瞬時轉(zhuǎn)染按試劑說明書進(jìn)行，首先用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋TrkB-siRNA，充分混勻后加入Lipofectamine200

17、0，室溫孵育15-20min后加入細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞并提取蛋白。
　　MTT法檢測細(xì)胞增殖:胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并制成單個細(xì)胞懸液，濃度調(diào)整為5×103個/ml，以每孔1×103個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200μ l，同時設(shè)置3個復(fù)孔。檢測前4h向每孔細(xì)胞中加入20μ lMTT(5mg/ml)。4h后終止培養(yǎng)，吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入150μ lDMSO，渦旋振蕩10min，充分混勻。選擇490nm波長，在

18、酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度值，以時間為橫坐標(biāo)，平均吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
　　AnnexinⅤ-FITC雙染檢測細(xì)胞凋亡:用冰冷PBS洗細(xì)胞2次，1×bindingbuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml。取100μ l細(xì)胞液（1×105個）至新EP管。加5μ lAnnexin V-FITC和5μ lPI。輕柔渦旋細(xì)胞混勻，室溫(15℃)避光孵育15min。再加入400μ l1×binding buffer，

19、之后上流式細(xì)胞儀分析。分別設(shè)置空白對照（只有細(xì)胞不加染料）和AnnexinⅤ-FITC單染及PI單染對照。結(jié)果為3次實驗的平均值。
　　Transwell細(xì)胞侵襲實驗:采用Transwell小室測定SW620細(xì)胞侵襲能力的變化。用預(yù)冷的無血清DMEM以1∶6稀釋Matrigel（基質(zhì)膠），上室加入100微升稀釋后的Matrigel，同時避免產(chǎn)生氣泡，37度孵箱中放置2h，使用前加入200微升無血清DMEM沖洗以重新水化并吸凈。Tr

20、kB-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移SW620細(xì)胞24h或ERK特異性抑制劑PD98059處理細(xì)胞24h后，將1×103個細(xì)胞接種在包被Matrigel的膜上并繼續(xù)培養(yǎng)24h。下層小室加入含有15％ FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。用棉簽小心擦去膜上表面未發(fā)生侵襲的細(xì)胞，而侵襲至膜下表面的細(xì)胞經(jīng)4％多聚甲醛固定后用Hoechst33342染細(xì)胞核，倒置熒光顯微鏡下觀察。隨機選取5個高倍視野計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。實驗至少重復(fù)3次，取平均值。
　　實

21、驗結(jié)果:
　　30例結(jié)腸癌組織中TrkB的表達(dá)高于癌旁組織，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組TrkB的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。統(tǒng)計學(xué)分析表明，結(jié)腸癌和癌旁組織中TrkB表達(dá)的相對灰度值分別為1.04±0.26和0.71±0.25，二者比較具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000)。淋巴結(jié)陽性和陰性組中TrkB表達(dá)的相對灰度值分別為1.15±0.17和0.95±0.29，二者比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，TrkB在結(jié)腸癌組織中表達(dá)

22、上調(diào)，而且淋巴結(jié)陽性的結(jié)腸癌組織中TrkB表達(dá)水平較高。
　　在癌旁組織中可見TrkB蛋白低表達(dá)。60例結(jié)腸組織均有不同程度的TrkB表達(dá)。我們觀察到40例(66.7％)結(jié)腸癌組織呈TrkB高表達(dá)（多于50％腫瘤細(xì)胞強著色，評分＞3）。同時我們對TrkB表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析。我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中TrkB高表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P=0.022)。而且TrkB高表達(dá)與腫瘤大小(T＜5cm vs

23、T≥5cm，P=0.232)和分化程度（高中分化vs低分化，P=0.422）均無關(guān)。
　　30例結(jié)腸癌癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶均有不同程度的TrkB表達(dá)。我們觀察到22例(73.3％)轉(zhuǎn)移灶呈TrkB高表達(dá)（多于50％腫瘤細(xì)胞強著色，評分＞3）。同時我們對TrkB高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。我們發(fā)現(xiàn)，癌旁淋巴結(jié)以遠(yuǎn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組TrkB高表達(dá)率為92.9％(13/14)，顯著高于癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組TrkB高表達(dá)率，兩組間差

24、異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)。
　　30例結(jié)腸癌癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞凋亡率為6.9-23.5％，平均為12.5％。同時我們對TrkB高表達(dá)與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。我們發(fā)現(xiàn)，癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)TrkB的腫瘤細(xì)胞平均凋亡率為11.6％，顯著低于低表達(dá)TrkB的腫瘤細(xì)胞的平均凋亡率，為15.0％，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.021)。
　　TrkB的表達(dá)以及ERK磷酸化與高轉(zhuǎn)移SW620細(xì)胞的侵

25、襲能力相關(guān):我們對SW480和SW620細(xì)胞中TrkB蛋白表達(dá)和ERK磷酸化水平進(jìn)行了比較。作為對照，低轉(zhuǎn)移SW480細(xì)胞中TrkB蛋白水平較低，同時在SW480細(xì)胞中也觀察到低水平磷酸化的ERK。而高轉(zhuǎn)移SW620細(xì)胞表達(dá)較高水平的TrkB蛋白，同時ERK的磷酸化水平也較高。此外，Transwell細(xì)胞侵襲實驗表明24h時侵襲至下層小室的SW620細(xì)胞數(shù)(42.9±7.6)顯著多于SW480細(xì)胞(23.8±3.9，P=0.000)。因

26、此，我們認(rèn)為TrkB的表達(dá)與SW620細(xì)胞的侵襲能力相關(guān)，ERK可能參與調(diào)節(jié)SW620細(xì)胞侵襲的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　干擾TrkB蛋白表達(dá)抑制SW620細(xì)胞增殖:我們應(yīng)用特異性siRNA轉(zhuǎn)染高表達(dá)TrkB的SW620細(xì)胞，研究其對細(xì)胞增殖的影響。TrkB-siRNA轉(zhuǎn)染5d后，SW620細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組和non-silencing細(xì)胞(P=0.001)，結(jié)果表明特異性TrkB-siRNA能夠顯著抑制SW620細(xì)胞增殖。
　

27、　干擾TrkB蛋白表達(dá)促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡:我們應(yīng)用特異性siRNA轉(zhuǎn)染高表達(dá)TrkB的SW620細(xì)胞，研究其對細(xì)胞凋亡的影響。對照組、non-silencing和TrkB-siRNA轉(zhuǎn)染組，SW620細(xì)胞的凋亡率分別為(6.10±1.95％，8.77±1.60％及25.81±2.95％，P=0.000)，結(jié)果表明TrkB-siRNA能夠顯著促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡。
　　干擾TrkB蛋白表達(dá)阻斷SW620細(xì)胞侵襲:我們應(yīng)用特異性

28、siRNA轉(zhuǎn)染高表達(dá)TrkB的SW620細(xì)胞，研究其對細(xì)胞侵襲能力的影響。我們對TrkB-siRNA轉(zhuǎn)染前后SW620細(xì)胞的侵襲情況進(jìn)行了比較。對照組、non-silencing和TrkB-siRNA轉(zhuǎn)染組，24h后侵襲至下層小室的細(xì)胞數(shù)分別為(45.6±3.8，42.8±1.9及27.6±2.6，P=0.001)，結(jié)果表明TrkB-siRNA能夠抑制SW620細(xì)胞侵襲能力。
　　干擾TrkB蛋白表達(dá)抑制ERK磷酸化:TrkB-s

29、iRNA轉(zhuǎn)染后，TrkB蛋白表達(dá)減少，而且SW620細(xì)胞中ERK的磷酸化水平降低。因此，TrkB蛋白可能通過活化ERK影響SW620細(xì)胞的生物學(xué)行為。這些結(jié)果表明，TrkB蛋白促進(jìn)SW620細(xì)胞增殖和侵襲可能與ERK信號通路的活化相關(guān)。
　　應(yīng)用ERK特異性化學(xué)抑制劑處理細(xì)胞對于SW620細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響:我們應(yīng)用SW620細(xì)胞研究參與TrkB相關(guān)的ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ERK抑制劑明顯降低了p-ERK水平，而對ERK蛋白

30、表達(dá)沒有影響。對SW620細(xì)胞應(yīng)用ERK抑制劑作用5d后，我們發(fā)現(xiàn)對照和處理組中SW620細(xì)胞數(shù)沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.544)，這表明特異性ERK抑制劑并不能影響SW620細(xì)胞增殖。我們進(jìn)一步研究ERK抑制劑對SW620細(xì)胞凋亡的影響。ERK抑制劑作用細(xì)胞24h后，對照和處理組中，SW620細(xì)胞的凋亡率分別為（6.28±1.59％和9.44±2.06％），兩組比較無差異(P=0.103)，結(jié)果表明ERK抑制劑對SW620細(xì)胞凋亡

31、沒有作用。最后，我們探討了ERK抑制劑對SW620細(xì)胞侵襲能力的影響。對照組和ERK抑制劑組，24h后侵襲至下層小室的細(xì)胞數(shù)分別為42.8±1.9和23.9±1.3，兩組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000)，因此阻斷ERK活化能夠顯著抑制細(xì)胞侵襲，進(jìn)一步表明ERK信號通路可能參與了TrkB介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲過程。
　　討論:
　　TrkB是一種受體酪氨酸激酶，其過表達(dá)通常與腫瘤轉(zhuǎn)移潛能增加相關(guān)，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤和胰腺導(dǎo)管癌，并

32、認(rèn)為直接導(dǎo)致這些腫瘤的侵襲行為。TrkB在多種人類腫瘤中過表達(dá)，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。TrkB過表達(dá)促進(jìn)早期星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的形成，并有助于神經(jīng)母細(xì)胞瘤耐受化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。然而，研究表明TrkB對于小鼠胚胎和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要。我們免疫組化結(jié)果也顯示結(jié)腸癌癌旁組織中腺上皮細(xì)胞有TrkB低表達(dá)，提示TrkB低水平表達(dá)可能有助于維持正常細(xì)胞的生長和分化。
　　研究表明，TrkB在前列腺癌組織中高表達(dá)，廣泛

33、表達(dá)于分級高的乳腺癌組織，但目前TrkB在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的研究尚未見報道。本研究應(yīng)用western blot方法比較了30例結(jié)腸癌和癌旁組織中TrkB蛋白表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示結(jié)腸組織中TrkB蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，二組間差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。同時免疫組化結(jié)果也顯示TrkB蛋白在結(jié)腸癌組織中均有表達(dá)，其中40例結(jié)腸癌為高表達(dá)(66.7％)，而癌旁組織中TrkB均為低表達(dá)。我們的結(jié)果提示TrkB蛋白過表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生

34、有關(guān)。
　　我們進(jìn)一步對TrkB高表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組TrkB高表達(dá)率為85.7％(18/21)，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組TrkB高表達(dá)率為56.4％(22/39)，二組間差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示隨著結(jié)腸癌出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期的增高，TrkB表達(dá)也逐漸增強。這提示我們TrkB可能與結(jié)腸癌的發(fā)展有關(guān)。
　　有人研究發(fā)現(xiàn)，TrkB的配體BDNF在多發(fā)性骨髓瘤中具有顯著的促

35、血管新生作用，Nakamura K等也發(fā)現(xiàn)TrkB被其配體BDNF活化后能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致血管發(fā)生以及新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。我們的免疫組化結(jié)果顯示TrkB高表達(dá)于某些腫瘤間質(zhì)中的內(nèi)皮細(xì)胞，因此TrkB是否能夠通過誘導(dǎo)淋巴管新生，從而促進(jìn)結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移還有待于進(jìn)一步研究。
　　本研究觀察到TrkB在癌旁組織中低表達(dá)，但TrkB在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，而且隨著結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期的增高而逐

36、漸增強。這提示我們，TrkB可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。然而TrkB蛋白在結(jié)腸癌中的調(diào)節(jié)機制仍需要細(xì)胞水平上的研究。
　　轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌惡性生物學(xué)行為的主要表現(xiàn)之一，通常是腫瘤治療失敗的主要原因。失巢凋亡（即缺少細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡）被認(rèn)為是阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的生理性屏障。耐受失巢凋亡的腫瘤細(xì)胞可以在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)存活，因此能夠在遠(yuǎn)隔器官內(nèi)形成轉(zhuǎn)移灶。研究發(fā)現(xiàn)，TrkB過表達(dá)有助于骨髓瘤細(xì)胞的存活，而阻斷Trk

37、B信號通路可以顯著降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存能力。TrkB在多種人類腫瘤中過表達(dá)，能夠增強肝癌細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)甲狀腺髓樣癌的發(fā)展演進(jìn)，Zhao等也發(fā)現(xiàn)TrkB廣泛表達(dá)于鼻咽癌組織，而且TrkB高表達(dá)與腫瘤體積、TNM分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此TrkB在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。
　　目前尚未見關(guān)于TrkB在結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)情況的研究報道，也沒有關(guān)于TrkB在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系的文獻(xiàn)報道。本研

38、究應(yīng)用免疫組化方法檢測30例結(jié)腸癌癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TrkB表達(dá)情況，并應(yīng)用TUNEL染色方法檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示TrkB蛋白在30例癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中均有表達(dá)，其中22例為高表達(dá)(73.3％)，細(xì)胞凋亡率為6.9-23.5％。我們對TrkB高表達(dá)與結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，癌旁淋巴結(jié)以遠(yuǎn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組TrkB高表達(dá)率為92.9％(13/14)，高于癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組TrkB高表達(dá)率，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意

39、義。結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞中TrkB表達(dá)越強，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越廣泛。這提示我們TrkB與結(jié)腸癌的發(fā)展演進(jìn)密切相關(guān)。有研究表明，TrkB具有保護(hù)細(xì)胞、抑制細(xì)胞凋亡的作用。因此我們進(jìn)一步對癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞中TrkB表達(dá)和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TrkB高表達(dá)與細(xì)胞凋亡顯著負(fù)相關(guān)。這提示我們，結(jié)腸癌中TrkB過表達(dá)可能通過抑制細(xì)胞凋亡，有助于腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)存活，繼而形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶并發(fā)生遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移。
　　本研究觀察到T

40、rkB在結(jié)腸癌癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞凋亡負(fù)相關(guān)，同時還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍越大，癌旁淋巴結(jié)中癌組織表達(dá)TrkB越強。這提示我們，TrkB可能在促進(jìn)結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。然而TrkB蛋白在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)節(jié)機制仍需要細(xì)胞水平上的研究。
　　盡管已有大量關(guān)于TrkB在腫瘤中表達(dá)的研究，但是有關(guān)TrkB促進(jìn)腫瘤發(fā)生演進(jìn)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前尚不太明確。有研究證實，活化的TrkB經(jīng)PI3K信號通路保護(hù)

41、神經(jīng)母細(xì)胞瘤耐受化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而且以Akt為靶點可以增強神經(jīng)母細(xì)胞瘤對化療的敏感性。我們的研究表明ERK信號通路可能參與TrkB促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲過程。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與低轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌SW480細(xì)胞相比，高轉(zhuǎn)移結(jié)腸腺癌SW620細(xì)胞中TrkB蛋白表達(dá)和ERK磷酸化水平較高。
　　我們應(yīng)用特異性TrkB-siRNA干擾SW620細(xì)胞中TrkB蛋白表達(dá)，觀察SW620細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲情況以及細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化水平的變化

42、。研究顯示具有侵襲和轉(zhuǎn)移性的肝癌細(xì)胞中TrkB的表達(dá)顯著增強，TrkB能夠增強卵巢癌細(xì)胞的增殖能力，使卵巢癌細(xì)胞耐受失巢凋亡。我們轉(zhuǎn)染TrkB-siRNA后發(fā)現(xiàn)，SW620細(xì)胞中TrkB蛋白表達(dá)下調(diào)，同時細(xì)胞增殖受到抑制。我們又檢測TrkB-siRNA作用SW620細(xì)胞前后，細(xì)胞凋亡情況的變化。結(jié)果表明阻斷TrkB蛋白表達(dá)后，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加。Walch等人研究發(fā)現(xiàn)，TrkB的表達(dá)與前列腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此我們進(jìn)一步探討下調(diào)T

43、rkB表達(dá)對SW620細(xì)胞侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)TrkB-siRNA能夠顯著抑制SW620細(xì)胞侵襲。同時，與對照組和轉(zhuǎn)染non-silencing細(xì)胞相比，我們檢測到隨著TrkB表達(dá)水平降低，ERK磷酸化水平也顯著降低。
　　ERK調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活，是多種生長因子的下游效應(yīng)蛋白。在多種人類腫瘤中都發(fā)現(xiàn)ERK的異?；罨珽RK信號通路在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。我們進(jìn)一步應(yīng)用ERK特異性化學(xué)抑制劑，觀察其對SW620

44、細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組細(xì)胞相比ERK抑制劑能夠顯著降低SW620細(xì)胞的侵襲能力，進(jìn)一步表明ERK信號通路的活化與SW620細(xì)胞較強的侵襲能力相關(guān)，ERK信號通路可能在TrkB介導(dǎo)的SW620細(xì)胞侵襲過程中具有重要作用，因此ERK信號通路可能是阻斷SW620細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要靶點。同時我們還發(fā)現(xiàn)ERK特異性抑制劑對SW620細(xì)胞的增殖和凋亡沒有影響，表明TrkB可能通過其他信號通路調(diào)控SW620細(xì)胞增殖和凋亡。然而

45、，TrkB-ERK對細(xì)胞侵襲的調(diào)節(jié)機制還有待于進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，TrkB高表達(dá)與SW620細(xì)胞侵襲能力和ERK磷酸化水平相關(guān)，TrkB具有抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲的作用。TrkB可能通過ERK信號通路的活化，促進(jìn)SW620細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。總而言之，我們的研究結(jié)果顯示，TrkB對SW620細(xì)胞的促侵襲作用主要與ERK信號通路的活化相關(guān)。對TrkB的深入研究可能為臨床阻斷結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的治療策略。
　　結(jié)論

46、:
　　1.TrkB在結(jié)腸癌組織中過表達(dá)，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。因此TrkB可能對結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。
　　2.結(jié)腸癌癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TrkB過表達(dá)與細(xì)胞凋亡顯著負(fù)相關(guān)，而且結(jié)腸癌癌旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中細(xì)胞凋亡越顯著，TrkB表達(dá)越低。因此TrkB可能對結(jié)腸癌細(xì)胞耐受凋亡并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。
　　3.干擾TrkB蛋白表達(dá)能夠降低高轉(zhuǎn)移結(jié)腸腺癌SW620細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增