CXCR4-CXCL12生物軸促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究.pdf

1、研究目的：
　　結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別是第二位和第三位，嚴(yán)重威脅人類的健康。結(jié)腸癌患者死亡的主要原因是轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)，為此人們對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的步驟主要包括，腫瘤細(xì)胞原發(fā)灶過(guò)度增殖及血管生成，分泌膠原酶降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和基底膜，細(xì)胞從原發(fā)部位分離脫落，浸潤(rùn)血管或淋巴管并在

2、血流中形成癌栓隨血流遷移，腫瘤細(xì)胞遷移至靶器官通過(guò)增殖和血管生成形成新生灶。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)十分復(fù)雜的動(dòng)態(tài)的生物學(xué)過(guò)程，由多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的步驟組成，每一個(gè)步驟涉及到多種分子事件。
　　目前對(duì)于腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的解釋很多，其中腫瘤“歸巢”學(xué)說(shuō)認(rèn)為某些腫瘤細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體，而靶器官高表達(dá)趨化因子，腫瘤細(xì)胞可以像白細(xì)胞一樣在趨化因子的誘導(dǎo)下向靶器官遷移。CXCL12是一種細(xì)胞趨化因子，其受體為細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體CXCR

3、4，CXCL12與CXCR4相互作用形成偶聯(lián)分子對(duì)，共同促進(jìn)白細(xì)胞和造血干細(xì)胞的遷移。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中高表達(dá)CXCR4，而其最常見的轉(zhuǎn)移部位如淋巴，肝等則高表達(dá)其配體CXCL12，并且從肝組織中提取的物質(zhì)對(duì)CXCR4高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞有很強(qiáng)的趨化作用。說(shuō)明CXCR4/CXCL12可能參與了結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程，但是其具體機(jī)制還不清楚。本課題主要通過(guò)外實(shí)驗(yàn)，研究CXCR4/CXCL12生物軸對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞促襲轉(zhuǎn)移的作用，在進(jìn)一

4、步確證CXCL12促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移活性的基礎(chǔ)上，探討其作用機(jī)制，為開發(fā)高效抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　首先用western blotting方法和實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)LOVO、HT-29、HCT-116、SW620和SW480五種結(jié)腸癌細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)情況。用Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA沉默HT-29中CXCR4的表達(dá)，western blotting方法檢測(cè)干擾不同時(shí)間點(diǎn)CXCR4的

5、表達(dá)情況。CCK-8和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCL12對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCL12對(duì)HT-29細(xì)胞遷移的影響，transwell小室檢測(cè)CXCL12對(duì)HT-29細(xì)胞侵襲的影響，western blotting方法檢測(cè)CXCL12對(duì)PI3K/AKT/mTOR，MEK/ERK及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。用NE-PER核膜分離提取試劑盒檢測(cè)CXCL12對(duì)HT-29細(xì)胞β-catenin核轉(zhuǎn)位的影響。

6、r>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　在LOVO、HT-29、HCT-116、SW620和SW4805種結(jié)腸癌細(xì)胞中，HT-29細(xì)胞的CXCR4mRNA和蛋白水平均比其他細(xì)胞高，因此選取CXCR4表達(dá)較高的HT-29細(xì)胞來(lái)研究CXCR4/CXCL12生物軸的生物效應(yīng)。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示，CXCR4siRNA在干擾24、48、72 h時(shí)，CXCR4的表達(dá)分別降低了61.1％、74.8％和82.4％。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示CXCL12能顯著促進(jìn)C

7、XCR4高表達(dá)的HT-29細(xì)胞的克隆形成，CXCR4被沉默掉之后CXCL12便失去了其促增殖的效果;遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CXCL12能顯著促進(jìn)HT-29細(xì)胞的遷移;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，40ng/mL的CXCL12能顯著促進(jìn)HT-29細(xì)胞的侵襲。CXCR4被沉默掉之后CXCL12便失去了其促侵襲遷移的效果;明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CXCL12可促進(jìn)HT-29細(xì)胞的MMP-9、MMP-2的表達(dá)。然而，CXCR4被沉默的HT-29細(xì)胞對(duì)

8、CXCL12的刺激沒有反應(yīng);在HT-29細(xì)胞中，CXCL12可快速引起AKT、mTOR、ERK的磷酸化，說(shuō)明CXCR4/CXCL12生物軸能激活PI3K/AKT/mTOR和MEK/ERK信號(hào)通路;CXCL12孵育48 h后，HT-29細(xì)胞內(nèi)總β-catenin的表達(dá)量沒有發(fā)生變化，但細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin提高了76.9％，CXCR4的沉默阻礙了CXCL12促進(jìn)β-catenin核轉(zhuǎn)位的作用。CXCL12還可以促進(jìn)β-catenin

9、下游蛋白CyclinD1、MMP-7和survivin的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　CXCR4/CXCL12生物軸具有促結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的效果，主要是通過(guò)促進(jìn)MMP-2，MMP-9的分泌和PI3K/AKT/mTOR、MEK/ERK及Wnt/β-catenin信號(hào)通路起到促侵襲轉(zhuǎn)移的作用。提示CXCR4/CXCL12生物軸可以作為一種潛在的抗侵襲轉(zhuǎn)移藥物靶點(diǎn)，針對(duì)CXCR4/CXCL12軸的療法可能會(huì)成為治療結(jié)腸癌