CXCL12-CXCR7調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞侵襲和血管生成能力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、趨化因子受體CXCR7在人肝細(xì)胞肝癌及肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)及意義
　　 目的：
　　 探討趨化因子受體CXCR7在人肝細(xì)胞肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織及肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而初步推測(cè)CXCR7在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法：
　　 應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)CXCR7在人肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織中的表達(dá)。Western-blot和RT-PCR在蛋白和mRNA水平上檢測(cè)CXCR7，CXC

2、R4在肝癌細(xì)胞株（HepG2，Hep3B，SMMC-7721，MHCC97L，MHCC97H和HCCLM6）及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 （1）CXCR7在人肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織、正常肝臟組織。
　　 （2）與HUVECs相比，CXCR7在人肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平較高。
　　 （3）侵襲能力強(qiáng)的肝癌細(xì)胞中CXCR7表達(dá)水平高于侵襲能力弱的肝癌細(xì)胞。

3、>　　 （4）在6株肝癌細(xì)胞及HUVECs中，均可見CXCR4的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 ①在人肝細(xì)胞肝癌組織中CXCR7表達(dá)較高，而癌旁組織、正常肝臟組織中表達(dá)較低。
　　 ②CXCR7在高侵襲力肝癌細(xì)胞中表達(dá)較高，從而初步推測(cè)CXCR7在肝癌細(xì)胞的侵襲能力中可能具有一定作用。
　　 第二部分、 OXCR7shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的：
　　 構(gòu)建CXCR7shRN

4、A真核表達(dá)載體，將CXCR7shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，特異性沉默肝癌細(xì)胞中CXCR7的表達(dá)。經(jīng)過G418穩(wěn)定篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)CXCR7shRNA重組質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞。
　　 方法：
　　 設(shè)計(jì)合成針對(duì)CXCR7的轉(zhuǎn)錄模板序列，構(gòu)建針對(duì)CXCR7的shRNA重組質(zhì)粒，并通過酶切和測(cè)序鑒定。將CXCR7shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，經(jīng)過G418篩選獲得長(zhǎng)效表達(dá)CX

5、CR7shRNA重組質(zhì)粒的細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。采用Western-blot檢測(cè)穩(wěn)定篩選細(xì)胞中CXCR7蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測(cè)CXCR7mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 （1）重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示，陽(yáng)性重組質(zhì)粒被BamHⅠ切開，而不能被PstⅠ切開。
　　 （2）熒光顯微鏡下觀察，CXCR7shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，經(jīng)G418穩(wěn)定篩選后，大量細(xì)胞均可見

6、綠色熒光。
　　 （3）經(jīng)G418穩(wěn)定篩選后獲得的細(xì)胞，用RT-PCR檢測(cè)CXCR7mRNA表達(dá)，轉(zhuǎn)染了CXCR7shRNA的細(xì)胞中CXCR7mRNA水平明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。
　　 （4）經(jīng)G418穩(wěn)定篩選后獲得的細(xì)胞，用Western-blot檢測(cè)CXCR7蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染了CXCR7shRNA的細(xì)胞中CXCR7蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，和對(duì)照組比較具有明顯差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　

7、①經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了針對(duì)CXCR7的shRNA重組質(zhì)粒。
　　 ②熒光顯微鏡下觀察，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CXCR7shRNA重組質(zhì)粒的SMMC-7721可見大量熒光。
　　 ③運(yùn)用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CXCR7shRNA重組質(zhì)粒的SMMC-7721中CXCR7的表達(dá)被有效沉默。
　　 第三部分、 CXCL12/CXCR7對(duì)人肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 目的：

8、>　　 特異性沉默CXCR7的表達(dá)后，研究其對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的侵襲、粘附、VEGF分泌和誘導(dǎo)血管生成能力的影響。VEGF刺激能否調(diào)節(jié)CXCR7的表達(dá)，以及對(duì)SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 方法：
　　 ①運(yùn)用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CXCL12誘導(dǎo)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力的影響。②運(yùn)用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)特異性沉默CXCR7對(duì)SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力的影響

9、。③運(yùn)用腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)特異性沉默CXCR7對(duì)SMMC-7721細(xì)胞粘附能力的影響。④運(yùn)用ELISA法，檢測(cè)特異性沉默CXCR7對(duì)SMMC-7721細(xì)胞VEGF分泌的影響。⑤運(yùn)用腫瘤細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)模型，檢測(cè)特異性沉默CXCR7對(duì)SMMC-7721細(xì)胞誘導(dǎo)體外血管生成能力的影響。⑤運(yùn)用RT-PCR和Western-blot，檢測(cè)VEGF刺激對(duì)SMMC-7721細(xì)胞和HUVECs中CXCR7表達(dá)的影響。⑥運(yùn)用Tr

10、answell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)VEGF刺激對(duì)SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 結(jié)果：
　　 （1）不同濃度CXCL12（0，10，100 ng/ml）誘導(dǎo)下，SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力隨CXCL12濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)為濃度依賴性。特異性沉默CXCR7的表達(dá)后，CXCL12（100 ng/ml）誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力減弱。
　　 （2）CXCL12（100 ng/ml）能夠誘導(dǎo)增

11、強(qiáng)SMMC-7721細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（FN和LN）的粘附能力。SMMC-7721細(xì)胞與LN的粘附能力比與FN的粘附能力強(qiáng)。
　　 特異性沉默CXCR7的表達(dá)后，CXCL12（100 ng/ml）誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞與FN和LN的粘附能力減弱。
　　 （3）CXCL12（100 ng/ml）能夠誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞分泌VEGF。特異性沉默CXCR7的表達(dá)后，CXCL12（100 ng/ml）誘導(dǎo)的SMMC-7

12、721細(xì)胞分泌VEGF的能力減弱。
　　 （4）特異性沉默CXCR7的表達(dá)后，SMMC-7721細(xì)胞誘導(dǎo)體外血管生成的能力減弱。
　　 （5）VEGF（50 ng/ml）刺激下，SMMC-7721細(xì)胞和HUVECs中CXCR7mRNA表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)為時(shí)間依賴性。
　　 VEGF（50 ng/ml）刺激下，SMMC-7721細(xì)胞和HUVECs中CXCR7蛋白表達(dá)水平上調(diào)，表現(xiàn)為時(shí)間依賴性。
　　 （6）VE

13、GF（50 ng/ml）預(yù)刺激后，SMMC-7721細(xì)胞的趨化侵襲能力增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 ①CXCL12能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)SMMC-7721細(xì)胞的侵襲、粘附和VEGF分泌能力。
　　 ②CXCR7表達(dá)被有效沉默后：CXCL12誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲、粘附和VEGF分泌的能力減弱；SMMC-7721細(xì)胞誘導(dǎo)體外血管生成的能力減弱。這些結(jié)果說明CXCL12/CXCR7軸能夠調(diào)節(jié)SMMC-7721細(xì)胞的侵襲、粘附、體外血管生

14、成的能力。CXCL12/CXCR7軸可能在肝癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起重要作用。
　　 ③VEGF刺激能夠上調(diào)CXCR7的表達(dá)，且上調(diào)的CXCR7是具有功能的。
　　 第四部分、 CXCR7沉默對(duì)人肝癌細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的影響
　　 目的：
　　 研究特異性沉默SMMC-7721細(xì)胞中CXCR7表達(dá)后，對(duì)SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　 方法：
　　 將未轉(zhuǎn)染的SMMC

15、-7721細(xì)胞、轉(zhuǎn)染了陰性shRNA的SMMC-7721細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CXCR7shRNA的SMMC-7721細(xì)胞，分別接種到裸鼠背部皮下，定時(shí)測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。裸鼠處死后，完整剝離腫瘤，稱取瘤重，并將腫瘤固定于4％多聚甲醛，石蠟包埋，切片。切片用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD31，計(jì)算MVD。取出裸鼠肺和肝臟，觀察有無轉(zhuǎn)移灶形成。
　　 結(jié)果：
　　 （1）CXCR7的表達(dá)被有效沉默后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCR7shR

16、NA組腫瘤體積明顯較小，生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而轉(zhuǎn)染了陰性shRNA組與對(duì)照組之間無明顯差異（P>0.05）。
　　 （2）CXCR7的表達(dá)被有效沉默后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCR7shRNA組腫瘤的重量明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而轉(zhuǎn)染了陰性shRNA組與對(duì)照組之間腫瘤重量無明顯差異（P>0.05）。
　　 （3）CXCR7的表達(dá)被有效沉默后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCR7shR

17、NA組腫瘤血管CD31的表達(dá)明顯較少，其MVD明顯小于對(duì)照組MVD，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而轉(zhuǎn)染了陰性shRNA組與對(duì)照組之間腫瘤血管生成均較多，兩組之間無明顯差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 ①CXCR7的表達(dá)被有效沉默后，能夠調(diào)節(jié)SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)。
　　 ②CXCR7對(duì)裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)，可能是通過抑制腫瘤血管生成而實(shí)現(xiàn)的。
　　 ③CXCR7的