AnnexinA2調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞荷-CD147微囊泡釋放促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲的研究.pdf

1、【背景】
　　肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，肝癌轉(zhuǎn)移是肝癌相關(guān)性死亡的重要原因。遷移和侵襲是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，癌基因和抑癌基因的表達(dá)失調(diào)及腫瘤局部微環(huán)境的變化在這一過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　AnnexinA2(ANXA2)是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，具有多種生物學(xué)功能。大量基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究均已證實(shí)，ANXA2在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程，是一個(gè)重要的腫瘤相關(guān)分子[

2、1]。3項(xiàng)不同國(guó)家不同時(shí)期的獨(dú)立研究發(fā)現(xiàn)，ANXA2在肝癌組織中表達(dá)異常增高，參與了正常肝細(xì)胞向肝癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，并提出ANXA2可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，但ANXA2在肝癌遷移、侵襲中的作用尚不明確[2-4]。本研究采用RNAi探索ANXA2對(duì)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　CD147是另一個(gè)重要的腫瘤相關(guān)分子，屬于免疫球蛋白超家族成員，刺激多種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloprotei

3、nase，MMPs)的分泌是該分子的主要功能之一。近年來(lái)的一些研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)釋放微囊泡的形式將CD147分子釋放到胞外，實(shí)現(xiàn)腫瘤—間質(zhì)間的交互作用[5]。而ANXA2的另一重要生物學(xué)功能是與質(zhì)膜結(jié)構(gòu)結(jié)合，參與包括質(zhì)膜和微囊泡運(yùn)輸在內(nèi)的多種膜相關(guān)事件[6,7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，ANXA2分子與CD147分子可能存在相互作用，但這一假說(shuō)并未得到進(jìn)一步證實(shí)[8]。基于上述文獻(xiàn)背景，我們提出ANXA2可能參與肝癌細(xì)胞荷-CD147微囊泡的

4、釋放，并通過(guò)這種方式參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲。
　　【目的】
　　探討ANXA2對(duì)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響及作用機(jī)制。
　　【方法】
　　1)LipofectAMINETM2000將siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和FHCC-98；2)RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)肝癌細(xì)胞中ANXA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，評(píng)價(jià)ANXA2特異性siRNA(si-ANXA2)的有效性；3)在M

5、illicell小室中構(gòu)建肝癌細(xì)胞(SMMC-7721和FHCC-98)與成纖維細(xì)胞(人胚肺成纖維細(xì)胞HPF-1)共培養(yǎng)體系，用小室遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)研究ANXA2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響；4)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)探索肝癌細(xì)胞中ANXA2表達(dá)水平對(duì)肝癌細(xì)胞自身及成纖維細(xì)胞MMP-2表達(dá)量的影響；5)細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中ANXA2和CD147的表達(dá)及分布情況；6)應(yīng)用膜蛋白提取試劑盒提取肝癌細(xì)胞總膜蛋白，用提取的肝癌細(xì)胞總膜蛋白進(jìn)行免疫

6、共沉淀實(shí)驗(yàn)(分別用ANXAmAb和CD147mAb包被AntibodyCouplingGel，以抗-JEVmAb作為對(duì)照)；7)低溫超速離心從肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離微囊泡(microvesicles，MV)，并進(jìn)行電鏡觀察；8)對(duì)分離得到的MV進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)；9)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行不同處理(轉(zhuǎn)染snc-RNA、轉(zhuǎn)染si-ANXA2、轉(zhuǎn)染si-CD147)，提取肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中MV；10)通過(guò)WesternBl

7、ot檢測(cè)，分析肝癌細(xì)胞中ANXA2表達(dá)水平對(duì)荷-CD147MV釋放的影響；11)明膠酶譜探討不同來(lái)源MV對(duì)成纖維細(xì)胞MMPs表達(dá)量的影響。
　　【結(jié)果】
　　1)si-ANXA能夠有效沉默肝癌細(xì)胞中ANXA2的表達(dá)；2)沉默肝癌細(xì)胞中ANXA2的表達(dá)能夠顯著抑制與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系中肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力；3)下調(diào)肝癌細(xì)胞中ANXA2的表達(dá)能夠有效抑制肝癌細(xì)胞及培養(yǎng)于肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中成纖維細(xì)胞MMPs的表達(dá)；4)ANX

8、A2與CD147在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞水平共定位(熒光雙染)；5)ANXA2與CD147在肝癌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中免疫共沉淀；6)肝癌細(xì)胞釋放荷-CD147MV；7)si-ANXA2或si-CD147轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞可下調(diào)MV中CD147表達(dá)；8)不同來(lái)源MV均有刺激HPF-1產(chǎn)生MMP-2的作用，將si-ANXA2或si-CD147轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞均可下調(diào)這種效應(yīng)。
　　【結(jié)論】
　　1)ANXA2具有增強(qiáng)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的作用，