GPR49基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖侵襲能力的影響.pdf

1、研究背景：
　　肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，以下簡(jiǎn)稱肝癌或HCC）占原發(fā)性肝癌90％以上，在全球癌癥發(fā)病率中居第5位，死亡率居第3位。中國(guó)是肝癌高發(fā)區(qū)，盡管肝癌的診斷和治療取得了較大的進(jìn)展，但療效仍然較差[1]。肝癌切除術(shù)后5年生存率為24%~50%，肝移植術(shù)后5年生存率也僅為47%~61%[2]；肝癌對(duì)全身化療與放療的療效差[3,4]。目前，肝癌的分子靶向治療取得了令人鼓舞的結(jié)果，多靶點(diǎn)、多激酶抑

2、制劑Sorafenib用于不能手術(shù)切除的晚期肝癌患者，可延長(zhǎng)總體生存期近3個(gè)月[5,6]。因此，進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找更高效、高選擇性的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高肝癌療效具有重要的臨床意義[7]。
　　肝臟的胚胎發(fā)生以及成熟過(guò)程中Wnt信號(hào)通路發(fā)揮重要作用，且對(duì)肝臟代謝功能調(diào)控也是必需的[8]。正常肝組織中β-catenin幾乎全部定位于細(xì)胞膜上，細(xì)胞核未見表達(dá)；肝硬化組織中β-catenin細(xì)胞膜的缺失率和細(xì)胞質(zhì)的異位表達(dá)率均顯

3、著高于正常肝組織；肝癌的癌組織中β-catenin在細(xì)胞膜的缺失率和細(xì)胞質(zhì)的異位表達(dá)率均高于正常肝組織和肝硬化組織。HBV的病毒調(diào)節(jié)蛋白HBX參與肝細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)的活化，伴隨 Wnt-1的 HBX異位表達(dá)通過(guò)穩(wěn)定胞質(zhì)β-catenin，活化Huh7細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號(hào)[9]。
　　目前對(duì) Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中最為關(guān)鍵的靶基因研究不多。日本東京癌癥

4、研究所在對(duì)人肝癌組織及肝癌細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)[10]：β-catenin外顯子3在 HCC組織中具有突變，這種突變常伴有一種 G蛋白配對(duì)受體 GPR49過(guò)度表達(dá)，其發(fā)生率為87.5%（14/16）。經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)，47%（18/38）肝癌組織內(nèi)GPR49過(guò)度表達(dá)高出癌旁組織3倍。將突變的β-catenin轉(zhuǎn)入小鼠培養(yǎng)的肝細(xì)胞可引起GPR49上調(diào)。因此，GPR49是Wnt/β-catenin信號(hào)通路被活化后的下游靶基因之一。

5、>　　研究目的：
　　探討原發(fā)性肝癌（肝癌）細(xì)胞系Huh7細(xì)胞中G蛋白偶聯(lián)受體49（GPR49）基因?qū)Ω伟┘?xì)胞侵襲能力的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制。
　　研究方法：
　　根據(jù)轉(zhuǎn)染的小干擾 RNA（si-RNA）不同，將 Huh7細(xì)胞分為 GPR49-siRNA（si-GPR49）組和陰性對(duì)照 NC-siRNA（si-NC）組，另設(shè)未轉(zhuǎn)染 Huh7細(xì)胞為對(duì)照組（control組）。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法和W

6、estern blot法分別檢測(cè)3組細(xì)胞GPR49、細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）的信使核糖核酸（mRNA）和蛋白的表達(dá)。采用MTT法和Transwell法分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力和侵襲能力。
　　采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為顯著性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　si-GPR49組GPR49 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為control組的(23.8±3.1)%（P＜

7、0.05）。與control組相比，si-GPR49組GPR49、cyclin D1、MMP9蛋白的表達(dá)量明顯降低（均為 P<0.05）。MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-GPR49組細(xì)胞在72 h的吸光度（OD）值（0.53±0.12）明顯低于control組的（1.35±0.28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。si-GPR49組平均穿膜細(xì)胞數(shù)為（13.6±2.5）個(gè)，明顯低于 control組的（65.3±6.1）個(gè)，