Notch1在肝癌組織中的表達及其對肝癌細胞侵襲能力的影響.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一,在我國,原發(fā)性肝癌是排名第二的致死性腫瘤疾病,每年大約有11萬-13萬患者死于肝細胞性肝癌,占全球肝癌患者死亡人數的45％。隨著現代檢測及治療手段的進步,原發(fā)性肝癌治療取得了長足進展,但由于其較高的轉移及復發(fā)率,總體預后依舊較差,積極尋找一種早期準確預測肝細胞肝癌惡性程度及預后的指標變得十分迫切。
　　Notch信號通路是一條進化上十分保守的信號轉導系統(tǒng),可調控細胞增殖、分化、凋亡等生物

2、學行為。其主要由受體、配體、DNA結合蛋白三部分組成。在胞漿內生成的Notch受體在高爾基體中經Furin類轉化酶水解為兩部分,二者之間通過非共價鍵形成異源二聚體并被轉運到細胞膜表面,當受體與配體結合后,在γ-分泌酶的水解作用下,切割Notch受體跨膜區(qū),并釋放Notch胞內段進入細胞核,從而啟動下游基因的轉錄,調控一系列生命活動。Notch1是Notch信號通路的跨膜受體之一,大量研究發(fā)現,Notch1在多種腫瘤中異常表達,并且與腫瘤

3、侵襲及轉移相關。但在肝癌中,Notch1的作用尚不明確。
　　目的:
　　研究Notch1在肝細胞肝癌組織中的表達情況及其與肝癌臨床病理特征的關系。檢測不同侵襲能力肝腫瘤及非腫瘤細胞系中Notch1的表達情況,設計合成特異性Notch1-siRNA,研究Notch1在肝癌細胞系MHCC97-H及HepG2侵襲轉移中的作用及其相關潛在機制。
　　方法:
　　用免疫組織化學法(SP法)檢測110例肝癌組織及其癌旁組織

4、中Notch1表達情況,并分析Notch1表達與肝癌各項臨床病理指標之間的相關性。用Westernblot方法檢測肝非腫瘤細胞系HL-7702、肝癌細胞系HepG2和MHCC97-H三種不同侵襲能力的細胞系中Notch1蛋白的表達情況,設計并合成針對Notch1基因特異性的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA),采用脂質體轉染MHCC97-H及HepG2兩種肝癌細胞系,通過Western blot及實時定量P

5、CR法分別檢測轉染后各組細胞Notch1蛋白和mRNA表達水平的變化。應用特異性Notch1-siRNA轉染的HepG2及MHCC97-H細胞,體外通過transwell小室基質侵襲實驗,觀察Notch1表達沉默之后,這兩種肝癌細胞系侵襲能力的變化,并應用Westernblot及ELISA的方法分別檢測兩種細胞系轉染前后MMP-2及MMP-9表達量以及活性的變化情況。
　　結果:
　　免疫組織化學染色發(fā)現,Notch1陽性染

6、色主要位于細胞膜中,為棕色及棕黃色顆粒樣,細胞漿中也有所表達。在肝癌組織中,30例(27.3%)陰性表達,32例(29.1%)弱陽性表達,21例(19.1%)中等陽性表達,27例(24.5%)強陽性表達。Notch1在肝癌組織中表達存在差異。在癌旁組織中,僅部分染色顯示為弱陽性,其余均為陰性。肝癌組織中Notch1的陽性表達與肝癌的AJCC分期(χ2=22.123,P<0.001)、門靜脈癌栓(χ2=9.068,P=0.003)這些因素

7、存在正相關性,與肝癌的分化程度(χ2=6.490,P=0.011)存在負相關性;而與肝癌患者的性別(χ2=0.490,P=0.484)、年齡(χ2=0.188,P=0.664)、腫瘤直徑(χ2=0.002,P=0.961)、腫瘤數量(χ2=2.220,P=0.136)、AFP表達量(χ2=1.392,P=0.238)這些因素無關。
　　相比肝非腫瘤細胞系,Notch1在兩種肝癌細胞系中均高表達。特異性Notch1-siRNA轉染M

8、HCC97-H以及HepG2后,通過westernblot和實時定量PCR的方法檢測發(fā)現這兩種肝癌細胞系中Notch1蛋白以及mRNA的表達均顯著下降,該siRNA可以成功的干涉Notch1的表達。
　　應用特異性Notch1-siRNA沉默肝癌細胞系MHCC97-H及HepG2中Notch1的表達,侵襲實驗結果顯示:Notch1-siRNA組兩種細胞系穿透小室膜的細胞數目明顯減少。Westernblot及ELLISA實驗檢測發(fā)現