Ebp1在肝癌細胞中的表達及對細胞生長增殖的影響.pdf

1、肝癌的發(fā)生是許多基因表達水平的改變導致細胞內出現一系列分子變化的結果。因而從基因水平研究肝癌的癌基因、抑癌基因的變化，尋找差異表達的基因，不僅可以在病理上尋找原因，同時可以為早期診斷和治療以及預后提供依據。
　　ErbB-3是表皮生長因子家族中的重要成員，而Ebpl（Ebp1）是新發(fā)現的一種 ErbB-3胞內結合蛋白。在外界刺激作用下 Ebpl與 ErbB-3分離到達核內，可抑制腫瘤細胞的生長增殖并誘導細胞分化。研究表明Ebpl抑

2、制細胞增殖的能力與其調控細胞周期相關基因有關。研究顯示，Ebpl基因具有p48和p42兩個部分，兩者表達對細胞增殖起不同的效應。p48位于細胞質和核內，過度表達促進細胞增值；而p42位于細胞質內，過度表達時將抑制細胞增值。盡管文獻報道，Ebp1與乳腺癌、前列腺癌及口腔鱗狀細胞癌細胞生長增殖有關，但是其在肝癌中的作用研究尚未見報道。由于綠色熒光蛋白（GFP）可在真核細胞內表達發(fā)出綠色熒光，可起到示蹤作用，因此，利用Northern blo

3、t方法觀察Ebp1基因mRNA在肝癌細胞中的表達，之后建立pEGFP-C1質粒為載體的pEGFP-C1-Ebp1真核表達質粒，并轉染到HEK293細胞，觀察Ebp1過表達對細胞生長增殖的影響。
　　首先提取培養(yǎng)的肝癌細胞中提取總RNA進行Northern blot觀察Ebp1基因mRNA的表達，之后利用聚合酶鏈式反應（PCR）技術擴增Ebp1基因，并建立Ebp1基因與綠色熒光蛋白（GFP）基因融合表達載體pEGFP-Ebp1；使用

4、脂質體法，將重組的Ebp1基因轉入293細胞，并利用熒光顯微鏡觀察細胞內綠色熒光的表達，轉染后第二天開始利用新霉素G418篩選，建立穩(wěn)定表達目的基因Ebp1的細胞系及分析克隆集落的形成，對陽性表達克隆細胞通過Western blot鑒定Ebp1蛋白的表達。
　　實驗結果如下：Northern blot結果顯示，與NIH3T3和HEK293細胞相比Hep3B、Hep G2和Huh-7肝癌細胞系中Ebp1基因mRNA過表達；構建了Eb

5、p1與EGFP融合表達載體pEGFPC1-Ebp1，且熒光顯微鏡下可見被轉染的HEK293細胞發(fā)出綠色熒光；Western blot鑒定結果穩(wěn)定表達細胞系過表達Ebp1蛋白；克隆集落形成實驗結果，轉染目的基因的細胞克隆數多于轉染空載體細胞。
　　以上的結果提示：
　　1.構建了Ebp1與GFP基因融合表達載體pEGFPC1-Ebp1，而且建立了穩(wěn)定表達該真核表達載體的HEK293細胞系；
　　2.肝癌細胞中Ebp1基因