HIF-1α對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：肝細(xì)胞肝癌(HCC)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，易侵襲轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，因而探索肝細(xì)胞癌的發(fā)病及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制是臨床研究的一大挑戰(zhàn)。肝癌生長(zhǎng)速度快，造成局部組織嚴(yán)重缺氧，缺氧狀況下中腫瘤仍能不斷增殖，浸潤(rùn)，極易侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這也是肝癌研究的重點(diǎn)及臨床治療的難點(diǎn)，但肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。此過程中起關(guān)鍵作用的是缺氧誘導(dǎo)因子-1 (hypoxia inducible factor-1 HIF-1)。HIF-1 是迄今為止發(fā)

2、現(xiàn)的唯一一個(gè)特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1 α在腫瘤組織中廣泛表達(dá)，對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移起重要作用。本研究通過應(yīng)用HIF-1 α抑制劑YC-1和HIF-1 α的反義寡核苷酸分別處理SMMC-7721肝癌細(xì)胞，觀察不同藥物濃度對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的作用和對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期及凋亡率的影響，榆洲bc1-2，bax，survivin mRNA和蛋白表達(dá)量的變化，明確缺氧誘導(dǎo)因子-1

3、對(duì)肝癌細(xì)胞周期和增殖調(diào)亡影響及可能機(jī)制，為明確肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制及采取相應(yīng)的治療措施提供理論依據(jù)。 方法：肝癌細(xì)胞系SMMC-7721分對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，試驗(yàn)組細(xì)胞分別施加HIF-1 α抑制劑YC-1和HIF-1 α的反義寡核苷酸干預(yù)，設(shè)濃度梯度和時(shí)間梯度。MTT 方法檢測(cè)不同藥物濃度對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖的作用；采用FCM檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)、不同藥物濃度對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期和凋亡率的影響；采用逆轉(zhuǎn)

4、錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，測(cè)定細(xì)胞bc1-2，bax，survivin mRNA表達(dá)的變化，以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，通過凝膠掃描儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳條帶的光密度值分析，將bc1-2，bax，survivin與β-actin比值作為bc1-2，bax，survivin mRNA表達(dá)水平的參數(shù)，對(duì)bc1-2，bax，survivin產(chǎn)物相對(duì)定量；以Western blot方法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞胞漿bc1-

5、2，bax，survivin蛋白表達(dá)的變化，同樣以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)bc1-2，bax，survivin蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析(GLM過程)檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著差異。 結(jié)果: 1. MTT比色法顯示： 1.1 YC-1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖具有抑制作用。不同濃度YC-1處理細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有顯著下降

6、，差異具有顯著性(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。YC-1處理細(xì)胞不同時(shí)間后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。隨YC-1處理濃度的增大、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值顯著下降，即YC-1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)，(P<0.05)(Fig.2，Table 1)。 1.2 HI

7、F-1 α的ASODN對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖具有抑制作用。不同濃度ASODN處理細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。HIF-1 a的ASODN處理細(xì)胞不同時(shí)間后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。隨ASODN處理濃度的增大、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值顯

8、著下降，即ASODN對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)(Fig.3，Table 2)(P<0.05)。 2. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布顯示： 2.1 不同濃度YC-1處理細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，各處理組G0/G1期細(xì)胞增多(P<0.05)，S期細(xì)胞減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞變化不明顯(P>0.05)。各實(shí)驗(yàn)組問比較，差異辦具有顯著性(P<0.05)。YC-1處理細(xì)胞不同時(shí)間后，與對(duì)

9、照組相比，各處理組G0/G1期細(xì)胞增多(P<0.05)，S期細(xì)胞減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞變化不明顯(P>0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。即YC-1可阻滯SMMC-7721細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期，該作用呈時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)(Fig 5、9，Table 3、4)。隨YC-1濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡百分率逐漸升高(Fig.6，Table 7)，(P<0.05)；(Fig.10，Table 9)

10、，(P<0.05)，呈時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。 2.2 不同濃度HIF-1 α的ASODN處理細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，各處理組GO/G1期細(xì)胞增多(P<0.05)，S期細(xì)胞減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞變化不明顯(P>0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。HIF-1 α的ASODN處理細(xì)胞不同時(shí)間后，與對(duì)照組相比，各處理組GO/G1期細(xì)胞增多(P<0.05)，S期細(xì)胞減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞變

11、化不明顯(P>0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。即ASODN可阻滯SMMC-7721細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期，該作用呈時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)(Fig.7、11，Table 5、6)。隨ASODN濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡百分率升高(Fig.4，Table 8)，(P<0.05)；(Fig.8，Table 10)，(P<0.05)，呈時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。 3. PCR結(jié)果顯示： 3.1 不同濃度

12、YC-1處理細(xì)胞不同時(shí)間后，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組bcl-2 mRNA和survivin mRNA表達(dá)均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)，各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。而bax的mRNA無明顯變化趨勢(shì)(P>0.05)。隨YC-1濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，SMMC-7721細(xì)胞bcl-2 mRNA(Fig.12、14，Table 11)和survivin mRNA(Fig.20、22，Table 13)表達(dá)顯著

13、下降，均呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05)。而bax的mRNA無明顯變化趨勢(shì)(Fig.16、18，Table 12)(P>0.05)。 3.2 不同濃度HIF-1 a的ASODN處理細(xì)胞不同時(shí)間后，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組bc1-2 mRNA和survivinmRNA表達(dá)均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。而bax的mRNA無明顯變化趨勢(shì)(P>0.05)。隨HIF-

14、1 a 的ASODN濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，bc1-2 mRNA(Vig.13、15，Table 14)和survivin mRNA(Fig.21、23，Table 16)表達(dá)顯著下降，均呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05)。而bax的mRNA無明顯變化趨勢(shì)(Fig.17、19，Table 15) (P>0.05)。 4. Western結(jié)果顯示： 4.1 不同濃度YC-1處理細(xì)胞不同時(shí)間后，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組b

15、c1-2和survivin的蛋白表達(dá)顯著下降，bax的蛋白表達(dá)顯著增加，差異具有顯著性(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。隨YC-1濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，SMMC-7721細(xì)胞bc1-2(Fig.24、26，Table i4)和 survivin(Fig.33、35，Table 22)蛋白表達(dá)顯著下降，bax的蛋白顯著增加(Fig.29、31，Table 18)，均呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05

16、)。 4.2 不同濃度HIF-1 a 的ASODN處理細(xì)胞不同時(shí)間后，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組bc1-2，survivin的蛋白表達(dá)逐漸減少，bax的蛋白逐漸增加，差異具有顯著性(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組問比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。隨HIF-1 a的ASODN濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，bc1-2(Fig.25、27，Table 17)和 survivin(Fig.32、34，Table 19)蛋白表達(dá)顯著下降，bax的

17、蛋白顯著增加(Fig.28、30，Table 21)，均呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05)。 結(jié)論: 1. 通過MTT法證實(shí)了YC-1和HIF-1α的ASODN具有對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞株增殖抑制作用，呈明顯的時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)，為肝癌的綜合治療提供了新的選擇。 2. 通過對(duì)細(xì)胞周期的測(cè)定，證明YC-1和HIF-1α的ASODN可以阻滯肝癌細(xì)胞于G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，作用呈明顯

18、的時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。 3. 通過對(duì)細(xì)胞凋亡率的測(cè)定，證明YC-1和HlF-1α的ASODN可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的調(diào)亡，凋亡率隨藥物濃度增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)增高，且呈明顯的時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。 4. HIF-1α促進(jìn)增殖抑制凋亡的機(jī)制是上調(diào)肝癌細(xì)胞Survivin和bcl-2的表達(dá)，下調(diào)bax的表達(dá)。這種作用呈明顯的時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。 5. 針對(duì)HIF-1α的抑制劑和反義寡核苷酸的應(yīng)用，為肝癌的治療提供了新的思路.