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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
肺癌是一種常見(jiàn)的肺部惡性腫瘤,其死亡率居癌癥死亡率之首。2008年,全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)表明,位于15號(hào)染色體長(zhǎng)臂的煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic Acetylcholine Repeptors,nAChRs)基因簇CHRNA5/A3/B4的變異與吸煙相關(guān)性肺癌密切相關(guān)。其中,編碼α5-煙堿型乙酰膽堿受體(α5-nAChR)的基因CHRNA5與肺癌的發(fā)生發(fā)展尤為相關(guān)。nAChRs是由α和β亞基組成的
2、同源或異源五聚體,nAChRs廣泛表達(dá)于中樞與周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)。目前在正常組織中nAChRs的功能研究較多,而在腫瘤中功能研究很少。如果能夠明確nAChRs亞基在肺癌細(xì)胞中的功能作用,那么,以nAChRs為基礎(chǔ)的治療有可能為肺癌的治療提供新的研究思路和治療靶點(diǎn)。
本研究通過(guò)下調(diào)α5-nAChR的表達(dá),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot、ELISA和MTT等實(shí)驗(yàn)方法,體外研究肺癌細(xì)胞中α5-nAChR對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子
3、(Hypoxia induced factor,HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial growth factor)表達(dá)的影響,從而進(jìn)一步探討α5-nAChR/HIF-1α/VEGF信號(hào)軸對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,為肺癌的預(yù)防治療尋找新靶點(diǎn)提供依據(jù)。
方法:
1.不同濃度尼古丁,作用于肺癌細(xì)胞株A549。熒光定量PCR檢測(cè)尼古丁作用下,A549細(xì)胞中α5-nAChR、HIF
4、-1α和VEGF mRNA的表達(dá);Western bolt檢測(cè)α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá);ELISA法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)。
2.設(shè)計(jì)合成編碼α5-nAChR的CHRNA5基因siRNA片段,經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)siRNA-α5-nAChR后,α5-nAChR、HIF-1α和VEGFmRNA的表達(dá);Western blot檢測(cè)α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá);ELIS
5、A法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)。
3.MTT法檢測(cè)α5-nAChR-siRNA對(duì)尼古丁促A549細(xì)胞增殖作用的的影響。
4.Western blot檢測(cè)siRNA-α5-nAChR對(duì)凋亡相關(guān)因子bcl-2和survivin的影響。
結(jié)果:
1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,隨著尼古丁濃度的增加,α5-nAChR和VEGF mRNA的表達(dá)逐漸上升,且1μmol/L尼古丁組α5-nAChR和
6、VEGF mRNA的表達(dá)升高最明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而各組間HIF-1α mRNA的表達(dá)沒(méi)有明顯變化(P>0.05)。
2.Western Blot結(jié)果顯示,隨著尼古丁濃度的增加,α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)隨尼古丁濃度的增加而增高,1μmol/L尼古丁組α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)升高最明顯,而5μmol/L尼古丁組α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì),表明α5-n
7、AChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)尼古丁濃度依賴(lài)性(P<0.05)。
3.ELISA結(jié)果顯示,隨著尼古丁濃度的增加,VEGF蛋白表達(dá)隨著尼古丁濃度的增加而增高,1μmol/L尼古丁組VEGF蛋白表達(dá)升高最明顯,而5μmol/L尼古丁組VEGF的蛋白表達(dá)明顯下降,表明VEGF的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)尼古丁濃度的依賴(lài)性(P<0.05)。
4.CHRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后,熒光定量PCR結(jié)果顯示,0μm
8、ol/L尼古丁組α5-nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA的相對(duì)水平為1,與si-NC轉(zhuǎn)染組相比,siRNA轉(zhuǎn)染組α5-nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)均下降(P<0.05)。與1μmol/L尼古丁組和(1μmol/LNicotine+si-NC)轉(zhuǎn)染組相比,(1μmol/L Nicotine+siRNA)轉(zhuǎn)染組,α5-nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)均下降(P<0.05)。
9、 5.CHRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后,Western Blot結(jié)果顯示,與尼古丁0μmol/L和si-NC轉(zhuǎn)染組相比,si-RNA組α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。與1μmol/L尼古丁組和(1μmol/LNicotine+si-NC)轉(zhuǎn)染組相比,(1μmol/L Nicotine+siRNA)轉(zhuǎn)染組,α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。
6.CHR
10、NA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后,ELISA結(jié)果顯示,與尼古丁0μmol/L和si-NC轉(zhuǎn)染組相比,si-RNA組VEGF的蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。與1μmol/L尼古丁組和(1μmol/LNicotine+si-NC)轉(zhuǎn)染組相比,(1μmol/L Nicotine+siRNA)轉(zhuǎn)染組,VEGF的蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。
7.CHRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后,無(wú)尼古丁處理組中,發(fā)現(xiàn)C
11、HRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖與陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖抑制率較對(duì)照組細(xì)胞高(P>0.05),尼古丁處理組,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞的增殖明顯受抑制(P<0.01)。
8.CHRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后,Western Blot結(jié)果顯示,與0μmol/L尼古丁組和si-NC轉(zhuǎn)染組相比,si-RNA組bcl-2和survivin蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.05)。與1μmol/L尼古丁組和(1
12、μmol/LNicotine+si-NC)轉(zhuǎn)染組相比,(1μmol/L Nicotine+siRNA)轉(zhuǎn)染組,bcl-2和survivin蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.05)。
結(jié)論:
1.尼古丁促進(jìn)A549細(xì)胞中α5-nAChR和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá),促HIF-1α蛋白的表達(dá),并且三者的表達(dá)都呈現(xiàn)尼古丁濃度的依賴(lài)性。
2.siRNA-α5-nAChR后,能夠抑制尼古丁促肺癌細(xì)胞的增殖作
13、用。同時(shí),HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)下降,提示α5-nAChR可能通過(guò)HIF-1α和VEGF影響肺癌細(xì)胞增殖,表明可能存在α5-nAChR/HIF-1α/VEGF信號(hào)軸,并在非小細(xì)胞肺癌的增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
3.siRNA-α5-nAChR后,HIF-1α、VEGF、bcl-2和suvivin蛋白的表達(dá)下降,提示,α5-nAChR可能通過(guò)HIF-1α和VEGF調(diào)節(jié)bcl-2和survivin表達(dá)進(jìn)而
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