α5-nAchR對尼古丁促人肺腺癌細胞增殖的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　 肺癌是一種常見的肺部惡性腫瘤，其死亡率已占癌癥死亡率之首。吸煙已被公認為引起肺癌的最重要的致癌因素之一。煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic Acetylcholine Receptors， nAchRs)信號途徑是近年來肺癌靶向研究的熱點。
　　 全基因組關聯(lián)分析表明，編碼α5-煙堿型乙酰膽堿受體（α5-nAchR）的CHRNA5基因與肺癌發(fā)生尤為相關，但α5-nAchR在肺癌發(fā)生中作用及機制的研究尚在

2、起步階段。本研究以非小細胞肺癌細胞株A549，H1299，H1975為研究對象，通過四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定尼古丁促細胞增殖的最適作用時間和濃度，觀察不同細胞株對尼古丁的敏感性；構建細胞饑餓模型，在尼古丁作用下，通過Westernblot研究α5-nAchR及細胞增殖信號通路下游信號分子p-Src418，p-Raf340，341-1，p-Rb807的表達變化。設計CHRNA5-siRNA片段并經脂質體介導轉染人肺癌A549細胞，通

3、過熒光顯微鏡觀察轉染效率，熒光定量PCR以及Westernblot等實驗方法，研究探討siRNA干擾CHRNA5基因表達對人肺腺癌A549細胞增殖的影響以及對下游信號通路的影響及機制。
　　 本研究旨在闡明α5-nAchR對尼古丁促人肺腺癌細胞增殖的影響及機制，為揭示肺癌的分子病理機制提供的實驗依據(jù)，對尋找腫瘤有效預防、治療新靶點工作有重要的現(xiàn)實意義。
　　 方法：
　　 1．通過基因測序法篩選三株α5-nAch

4、RSNP398不同基因型的肺腺癌細胞株，四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測比較在不同濃度和不同時間下尼古丁對三株細胞細胞增殖的影響。
　　 2．構建細胞饑餓模型，在尼古丁作用下，通過Western blot等方法檢測α5-nAchR及細胞增殖Raf/MEK/ERK信號通路相關分子p-Src418，p-Raf340，341-1，p-Rb07的表達變化。
　　 3．設計合成CHRNA5-siRNA片段，并經脂質體介導轉染人肺癌A

5、549細胞。熒光顯微鏡觀察轉染效率，熒光定量PCR、Western blot方法檢測細胞轉染后α5-nAchRmRNA和蛋白表達。
　　 4．采用四甲基偶氮唑藍顯色法(MTT)觀察siRNA干擾CHRNA5表達對尼古丁促人肺癌A549細胞增殖的影響。
　　 5．尼古丁處理組和(RNAi干擾+尼古丁處理)組，比較分析細細胞增殖Raf/MEK/ERK信號通路相關分p-Src418，p-Raf340.341-1，p-Rb807

6、的表達變化，探討α5-nAchR在尼古丁促進細胞增殖的作用及機制。
　　 結果：
　　 1．A549、H1299和H1975細胞株的SNP398基因型分別為野生型(A/A)，基因突變純合型(A/G)和雜合型(G/G)。尼古丁促進肺腺癌細胞株的細胞增殖，且存在與劑量和時間的相關性。A549和H1299細胞在1μM/L尼古丁處理24h后，細胞增殖最為顯著（PA549＜0.01，PH1299＜0.05）。而H1975細胞在10

7、pM/L尼古丁處理24h時后，細胞增殖最顯著(PH1975＜0.01)。
　　 2.0.5％新生牛血清作用48小時，使細胞處于饑餓狀態(tài)，在尼古丁的作用下，與陰性對照組相比，p-Src418、p-Raf340，341-1、p-Rb807分別在15分鐘、2小時和6小時被激活(P＜0.05)。
　　 3．CHRNA5-siRNA可顯著抑制A549細胞中CHRNA5 mRNA和蛋白水平的表達(P＜0.05)。
　　 4．

8、RNA干擾下調CHRNA5表達后，肺癌細胞生長速度趨于降低。在尼古丁的作用下，與對照組相比，RNAi轉染組A549細胞的增殖明顯受抑制(P＜0.01)。(RNAi干擾+尼古丁處理)組與尼古丁處理組相比，影響細胞增殖相關分子p-Src418，p-Raf340，341-1，p-Rb807的表達。其中，p-Src418，p-Raf340，341-1激活受到抑制，p-Rb807去磷酸化作用減弱(P＜0.05)。
　　 結論：
　　

9、 1．α5-nAchRSNP398變異體肺腺癌細胞株對尼古丁的敏感性不同，表明α5-nAchRSNP398基因多態(tài)性可能參與肺腺癌細胞對尼古丁的應答。
　　 2．siRNA干擾沉默CHRNA5在肺癌細胞中的表達可以抑制尼古丁促肺癌細胞的增殖，提示CHRNA5可能是肺癌治療的潛在靶點之一。
　　 3．α5-nAchR參與Raf/MAPK激酶/ERK信號通路促進非小細胞肺癌的細胞增殖，為肺癌病因學和靶向治療研究提供新的實驗