Rapamycin聯(lián)合SAHA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的放療增敏效應(yīng)及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　觀察雷帕霉素（Rapamycin）聯(lián)合組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histonedeacetylaseinhibitor，HDACi）辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilidehydroxamicacid，SAHA）對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞放療敏感性的影響并探討可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.Rapamycin、SAHA聯(lián)合用藥劑量確定：體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，給予不同濃度Rapamycin（0nmo

2、l/L、0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L）、SAHA（0μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）以及兩藥交叉聯(lián)合處理24h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算兩藥聯(lián)合作用A549細(xì)胞24h后10％細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的濃度（IC10）。
　　2.觀察Rapamycin聯(lián)合SAHA對(duì)A549細(xì)胞放療敏感性影響：A549細(xì)胞給予IC10處理

3、24h，后給予4GyX線照射，采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞增殖活性。
　　3.Rapamycin聯(lián)合SAHA放療增敏機(jī)制研究
　?。?）檢測(cè)Rapamycin聯(lián)合SAHA對(duì)A549細(xì)胞放療后DSBs修復(fù)影響：A549細(xì)胞給予IC10處理24h，后給予4GyX線照射，采用Westernblot和免疫熒光檢測(cè)放療后1h和24hγ-H2AX蛋白表達(dá)變化和焦點(diǎn)形成；采用Westernblot檢測(cè)放療后4hRad51、Ku80

4、、Ku70蛋白表達(dá)變化；采用RT-qPCR檢測(cè)放療后4hRad51mRNA、Ku80mRNA、Ku70mRNA表達(dá)變化。
　?。?）檢測(cè)Rapamycin聯(lián)合SAHA對(duì)A549細(xì)胞自噬和乙酰化影響：A549細(xì)胞給予Rapamycin或/和SAHA處理24h，以及4GyX線照射，采用透射電鏡檢測(cè)A549細(xì)胞自噬體形成情況；Westernblot檢測(cè)LC3、p62表達(dá)變化。A549細(xì)胞給予SAHA、Rapamycin+SAHA處理24

5、h，采用Westernblot檢測(cè)乙酰化組蛋白H3（Acetyl-HistoneH3，Ac-H3）表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.Rapamycin、SAHA聯(lián)合用藥劑量確定：Rapamycin和SAHA對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)均具有抑制作用，呈劑量依賴性；聯(lián)合用藥組對(duì)A549細(xì)胞的抑制率較單獨(dú)用藥組增高（p＜0.05）。兩藥聯(lián)合劑量濃度IC10=Rapamycin:100nmol/L；SAHA:2.5μmol/L。
　　2

6、.Rapamycin聯(lián)合SAHA影響A549細(xì)胞放療敏感性：細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTL組、IR組、IR+R組、IR+S組、IR+R+S組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（survivalfraction，SF）分別為100.0±0.00%、67.8±6.32%、43.1±7.18%、58.5±1.17%、21.1±7.01%，相比IR組，IR+R+S組SF下降最明顯（p＜0.05）。
　　3.Rapamycin聯(lián)合SAHA影響A549細(xì)胞DSB

7、s修復(fù)過程：
　?。?）Westernblot和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比CTL組，放療后1h各實(shí)驗(yàn)組γ-H2AX蛋白和γ-H2AX焦點(diǎn)表達(dá)增加（p＜0.05），組間無差異（p＞0.05），24h后各實(shí)驗(yàn)組γ-H2AX蛋白和γ-H2AX焦點(diǎn)表達(dá)均有所下降，IR+R+S組下降幅度最小（p＜0.05）。
　?。?）Westernblot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比CTL組，IR組Rad51蛋白表達(dá)增加（p＜0.05），Ku80、Ku70蛋

8、白表達(dá)無顯著差異（p＞0.05）。相比IR組，IR+R組、IR+R+S組Rad51蛋白表達(dá)下降（p＜0.05），IR+R組、IR+S組、IR+R+S組Ku80蛋白表達(dá)下降（p＜0.05），IR+R+S組Ku70蛋白表達(dá)下降（p＜0.05）；相比各實(shí)驗(yàn)組IR+R+S組Rad51、Ku80、Ku70蛋白表達(dá)下降最大（p＜0.05）。
　　（3）RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比CTL組，放療后4hIR組、IR+R組Rad51、Ku80、

9、Ku70mRNA表達(dá)均有所增加（p＜0.05），組間無差異（p＞0.05）。相比IR組，IR+S組、IR+R+S組Rad51、Ku80、Ku70mRNA表達(dá)均有不同程度下降（p＜0.05），組間無差異（p＞0.05）。
　　4.Rapamycin聯(lián)合SAHA影響A549細(xì)胞自噬和乙?；剑?br>　　（1）透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rapamycin、放療均能使A549細(xì)胞自噬體形成增加，Rapamycin作用最為明顯。Westernb