煙酰胺對非聚焦超聲殺傷GLC-82肺腺癌細胞增敏作用的實驗研究.pdf

1、目的和意義：本課題旨在探討煙酰胺是否能夠提高癌細胞對超聲波殺傷的敏感性，從而提高非聚焦超聲滅殺癌細胞的能力，達到殺滅組織中，特別是胸水和腹水中彌漫分布的癌細胞的目的。在此基礎上進一步探討其增敏原理，為基于煙酰胺增敏的肺癌治療奠定基礎。 材料與方法： 一、非聚焦超聲對懸液中人GLC-82肺腺癌細胞殺傷的實驗研究實驗分組： 1、劑量分組：實驗分為五組，非聚焦超聲的作用強度分別為0 W/cm<'2>、20W/cm<'2

2、>、30W/cm<'2>、40 W/cm<'2>、50W/cm<'2>五個不同劑量，作用時間均為5 s。 2、作用時間分組：實驗分為五組，非聚焦超聲的作用時間分別為0 s、5 s、10 s、15 s、20 s五個不同作用時間，作用強度均為20W/cm<'2>。 實驗方法：臺盼藍拒染法測NFU輻照GLC-82肺腺癌細胞后細胞的即刻存活率；MTT法檢測NFU作用后24 h細胞的存活率；流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率。

3、 二、煙酰胺對人GLC-82肺腺癌細胞體外作用的實驗研究 實驗分為A、B、C、D、E、F六組，其中A組為未加煙酰胺的正常細胞；B、C、D、E、F組煙酰胺的濃度分別為1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml五個不同劑量。 實驗方法：熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化；MTT法檢測不同濃度煙酰胺培養(yǎng)細胞后細胞的存活率；劃痕試驗檢測不同濃度的煙酰胺對細胞愈合力的影響；流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡

4、率。 三、煙酰胺對非聚焦超聲殺傷GLC-82肺腺癌細胞增敏作用的實驗研究 實驗分為Control、NA、NFU和NFU-NA四組，Control組(空白對照組)：不含煙酰胺不做任何處理，為正常培養(yǎng)GLC-82細胞；NA組(單純煙酰胺組)：煙酰胺濃度為3 mg/ml；NFU組(單純超聲組)：不含煙酰胺，NFU劑量為3W/cm<'2>×5S：NFU-NA組(非聚焦超聲煙酰胺增敏組)：NFU(30 W/cm<'2>×5S)輻照

5、前30 min給于3 mg/ml的NA。 實驗方法：MTT法檢測細胞存活分數(shù)；熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化；克隆形成實驗檢測細胞集落形成能力；核仁組成區(qū)染色分析細胞核仁組成區(qū)的變化；掃描電鏡觀察GLC-82細胞表面超微結(jié)構(gòu)的變化；流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率。 實驗結(jié)果 一、非聚焦超聲對懸液中人GLC-82肺腺癌細胞殺傷的實驗研究 1、GLC-82細胞的即刻存活率隨著非聚焦超聲功率和作用時間的不斷增加而明

6、顯下降； 2、經(jīng)非聚焦超聲作用后，鏡下可見大量的細胞碎片和類焦化物質(zhì)及死亡的細胞，且隨NFU作用時間和劑量的增加而增多，部分細胞出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象； 3、超聲輻照24 h后，隨著超聲輻照時間和劑量的不斷增加，細胞的存活率明顯下降，不同作用時間組之間、不同劑量組之間細胞的存活率差異均有顯著性(P<0.05)； 4、單純NFU超聲組細胞的凋亡率均明顯高于空白對照組，其中30 W/cm<'2>組細胞的即刻和24 h凋亡率最高

7、。 二、煙酰胺對人GLC-82肺腺癌細胞體外作用的實驗研究 1、煙酰胺誘導細胞凋亡程度與用藥劑量呈正相關，當煙酰胺的濃度小于3mg/ml時對GLC-82細胞凋亡率的影響不大，而4mg/ml和5mg/ml時細胞的凋亡率明顯升高，凋亡的細胞呈現(xiàn)邊界不清，體積縮小，核固縮，染色質(zhì)凝集、邊緣化，甚至細胞發(fā)生破碎，凋亡小體形成； 2、煙酰胺對細胞的抑制作用與藥物濃度呈正相關，24 h時煙酰胺對細胞的半數(shù)抑制劑量ICso最高

8、； 3、隨著煙酰胺濃度的增高GLC-82細胞向劃痕區(qū)的愈合速度不斷減慢，80 h時空白對照組劃痕區(qū)細胞基本上長滿(97.28％)，1 mg/ml-3 mg/ml組劃痕區(qū)均出現(xiàn)不同程度的變窄，而4 mg/ml和5 mg/ml組細胞劃痕區(qū)不但沒有變窄反而增寬，同時鏡下可見部分細胞壞死脫落，細胞間隙增寬； 4、煙酰胺的濃度大于等于3 mg/ml時，細胞周期主要表現(xiàn)為G<,1>期比例的上升伴隨S期比例的下降。 三、煙酰胺

9、對非聚焦超聲殺傷GLC-82肺腺癌細胞增敏作用的實驗研究 1、隨著濃度的增加，煙酰胺對非聚焦超聲的增敏作用則不斷升高，當濃度為3 mg/ml、4mg/ml和5 mg/ml時其增敏比明顯增高，分別為1.765、2.108和2.352； 2、NFU-NA增敏組細胞的克隆形成率為2.2％，明顯小于空白對照、非聚焦超聲及煙酰胺單獨作用組； 3、熒光顯微鏡下，NFU-NA增敏組作用24 h后GLC-82細胞形態(tài)改變：染色質(zhì)

10、凝集、核固縮，熒光強度增強，凋亡小體形成； 4、掃描電鏡下，NFU-NA增敏組細胞發(fā)生皺縮變圓，表面的微絨毛和絲狀結(jié)構(gòu)明顯減少； 5、NFU-NA增敏組細胞的核分裂象比例明顯低于空白對照、NFU及NA單獨作用組，而核固縮及核碎裂顯著高于其他3組； 6、NFU-NA增敏組細胞核的AgNORs無論從數(shù)量上還是從形態(tài)分布上均出現(xiàn)較明顯的變化：細胞核內(nèi)AgNORs顆粒數(shù)目減少，明顯低于空白對照、NFU及NA單獨作用組；

11、 7、NFU-NA增敏組GLC-82細胞的凋亡指數(shù)高于空白對照、煙酰胺及超聲單獨作用組，表現(xiàn)為S期和G2期比例的上升。 結(jié)論： 一、非聚焦超聲能殺傷懸液中人GLC-82肺腺癌細胞并抑制其增殖；較低功率的非聚焦超聲作用后細胞以凋亡為主要改變，較高功率時則以直接滅殺癌細胞為主； 二、隨著煙酰胺濃度的增加，GLC-82肺腺癌細胞的存活率呈下降趨勢，凋亡率則呈上升趨勢；當濃度達到或大于3mg/ml時，則細胞周期阻滯