陽和湯大鼠含藥血清對人肺癌GLC-82細胞作用及作用機制的實驗研究.pdf

1、目的：探討陽和湯大鼠含藥血清對人肺癌GLC-82細胞作用及其作用機制，為臨床應用陽和湯治療肺癌提供理論依據(jù)。同時也為中醫(yī)溫陽法抗癌提供理論依據(jù)。 方法：本研究分為生理鹽水對照組、陽和湯組(姜炭2g、鹿角膠9g、肉桂3g、熟地30g、白芥子6g、生甘草3g、麻黃2g)、陽和湯熱藥組(姜炭2g、鹿角膠9g、肉桂3g)、陽和湯非熱藥組(白芥子6g、生甘草3g、麻黃2g、熟地30g)，三個中藥組以低、中、高劑量各分為三組，共10組。用低

2、、中、高劑量的陽和湯、陽和湯熱藥、陽和湯非熱藥水煎劑分別給SD大鼠灌胃，制備低、中、高劑量陽和湯、熱藥、非熱藥含藥血清；并用相同的方法同時制備生理鹽水對照血清。以上述血清分別作用于人肺腺癌GLC-82細胞：采用MTI、法觀察陽和湯含藥血清、熱藥含藥血清、非熱藥含藥血清在24h、48h、72h對GLC-82細胞生長的抑制作用，流式細胞術(shù)檢測上述含藥血清在48h時對GLC-82細胞周期的變化和凋亡的影響。光鏡下觀察上述血清作用前后GLC-8

3、2細胞的形態(tài)學變化。應用細胞免疫化學法檢測上述血清作用于GLC-82細胞后凋亡相關(guān)蛋白bcl-2的表達情況。 結(jié)果：1陽和湯高劑量血清組的吸光度值在48h和72h時低于對照組血清，并且有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；同時可以看到其作用24h、48h、72h的生長抑制率分別為-1.1％、45.2％、74.6％，并且隨著作用時間延長，其吸光度逐漸降低，抑制率逐漸增高。陽和湯熱藥高劑量血清組在48h和72h時的吸光度值低于對照血清組

4、，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；同時可以看到陽和湯熱藥高劑量血清組24h、48h、72h時生長抑制率分別為-0.4％、36.4％、59.8％，并隨著作用時間的延長，其吸光度值逐漸降低，抑制率逐漸增高。陽和湯非熱藥高劑量組的吸光度在72h時低于對照血清組，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；同時可以看到其在24h、48h、72h生長抑制率分別為-1.8％、0.8％、9.3％，并且隨著作用時間的延長，其吸光度并不逐漸降低，而抑制率逐漸增高

5、。陽和湯高劑量血清組抑制率在48h、72h高于相對應的熱藥組高劑量血清組和非熱藥高劑量血清組，有顯著統(tǒng)計學差異 (P<0.01)；高劑量熱藥血清組抑制率在48h、72h高于相對應的高劑量非熱藥血清組，并有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)。其他藥物血清組與對照血清組的吸光度值之間沒有統(tǒng)計學意義。2低、中、高劑量陽和湯血清組的S期細胞所占比例在作用48h時均低于對照血清組，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中中、高劑量陽和湯血清組的G0/G1

6、期所占比例均高于對照血清組，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。低、中、高劑量陽和湯熱藥血清組的S期細胞所占比例在作用48h時均低于對照血清組，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而三組的G0/G1期所占比例均高于對照血清組，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。陽和湯非熱藥高劑量血清組的S期細胞所占比例在作用48h時低于對照血清組，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，同時低、中、高劑量陽和湯非熱藥血清組的G0/G1期所占比例均高于對照血清組，有

7、顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。中劑量陽和湯組S期細胞所占比例低于中劑量熱藥組和中劑量非熱藥組，并且有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；中劑量陽和湯熱藥組 S 期細胞所占比例低于中劑量非熱藥組，并且有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；高劑量陽和湯組G0/G1期所占比例要高于高劑量熱藥組和高劑量非熱藥組，并有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示陽和湯、陽和湯熱藥、陽和湯非熱藥均有阻滯細胞周期作用，但是差異不明顯。3陽和湯中、高劑量血清的凋亡率在作

8、用48h時分別為24.64％、28.76％，均高于對照血清組，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；并且隨著劑量的增高凋亡率逐漸增大，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽和湯熱藥中、高劑量血清的凋亡率在含藥血清作用48h時分別為18.57％、23.6％，均高于對照血清組，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01.)；并且隨著劑量的增高凋亡率逐漸增大，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其它中藥血清組與對照血清組之間的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。陽

9、和湯中、高劑量血清組的凋亡率高于相對應的陽和湯熱藥中、高劑量血清組和陽和湯非熱藥中、高劑量血清組，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽和湯熱藥中、高劑量血清組的凋亡率高于相對應的陽和湯非熱藥中、高劑量血清組，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。4倒置顯微鏡觀察，可見高劑量陽和湯、高劑量陽和湯熱藥含藥血清處理后，GLC-82細胞變小、變圓，懸浮于培養(yǎng)液中，胞漿透亮度下降，核顏色加深，折光性增強；HE染色光鏡觀察，可見以上含藥血清處理后，GLC-

10、82細胞體積縮小，變圓，胞膜皺縮，胞核內(nèi)染色質(zhì)密度增高，呈半月形凝集在核膜周邊，顯示典型的凋亡細胞特點。其他血清組變化不明顯。5 免疫細胞化學法檢測結(jié)果顯示，對照血清組和陽和湯非熱藥組的凋亡相關(guān)蛋白blc-2的表達呈強陽性。低、中、高劑量陽和湯組的含藥血清組凋亡相關(guān)蛋白blc-2表達降低，均呈陰性。低、中、高劑量陽和湯非熱藥組的含藥血清組凋亡相關(guān)蛋白blc-2表達也降低，呈弱陽性，但是其凋亡相關(guān)蛋白blc-2表達高于相對應的低、中、高陽

11、和湯組的含藥血清組。 結(jié)論：本研究顯示：1陽和湯可明顯抑制GLC-82細胞的增殖，可阻滯細胞周期于G0/G1期，減弱bcl-2的表達，誘導細胞凋亡，并存在一定的劑量-時間依賴性。提示陽和湯具有一定的抗肺癌作用，可能通過阻滯細胞周期和誘導凋亡發(fā)揮抗癌作用。2陽和湯熱藥可明顯抑制GLC-82細胞的增殖，可阻滯細胞周期于G0/G1期，減弱bcl-2的表達，誘導細胞凋亡，并存在一定的劑量-時間依賴性。提示陽和湯熱藥具有一定的抗肺癌作用，

12、可能通過阻滯細胞周期和誘導凋亡發(fā)揮抗癌作用。3高劑量的陽和湯非熱藥具有一定的抗肺癌作用，可以阻滯細胞周期于G0/G1期，誘導細胞凋亡，但是機制不明。4本實驗提示：陽和湯在抑瘤率、阻滯細胞周期于G0/G1期、凋亡率、抑制抗凋亡蛋白bcl-2表達等方面作用較陽和湯熱藥和陽和湯非熱藥明顯，而陽和湯熱藥在這些方面的作用較陽和湯非熱藥明顯。說明陽和湯整方的抗腫瘤作用高于陽和湯熱藥和陽和湯非熱藥。陽和湯熱藥可能在陽和湯整方抗腫瘤作用中起主導作用。陽