中藥復(fù)方含藥血清對雷公藤致骨髓細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機制研究.pdf

1、雷公藤有大毒，對消化、生殖、泌尿、心血管、骨髓及血液等系統(tǒng)有明確的病理損害。自1991年有文獻(xiàn)報道雷公藤對骨髓及血液系統(tǒng)的毒副作用以來，有關(guān)雷公藤致骨髓及血液系統(tǒng)毒性的實驗研究較少，其機制研究也未見報道。本課題選擇體外培養(yǎng)的大鼠股骨骨髓細(xì)胞為研究對象，觀察雷公藤醇提物對骨髓細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以豐富對雷公藤骨髓及血液系統(tǒng)毒性的認(rèn)識。同時，采用血清藥理學(xué)方法，觀察中藥復(fù)方含藥血清對雷公藤醇提物作用后骨髓細(xì)胞的保護(hù)作用，以期從中篩選出能有

2、效對抗雷公藤骨髓及血液系統(tǒng)毒性的最佳方劑，并對其機制進(jìn)行初步探討。鑒于雷公藤藥材尚未收入國家藥品標(biāo)準(zhǔn)，本課題首先對本實驗中所用的雷公藤藥材進(jìn)行質(zhì)量分析研究。同時，為了進(jìn)一步了解雷公藤的毒性作用，我們對雷公藤進(jìn)行了急性毒性試驗，測定LD50，以初步判斷可能的主要毒性靶器官。
　　 第一部分雷公藤主要毒性成分分析及其急性毒性考察
　　 方法：選擇雷公藤總二萜內(nèi)酯和雷公藤甲素作為檢測指標(biāo)，分別采用比色法和HPLC法，從有效成分

3、總量和單一有效成分兩個水平，對本課題所用雷公藤進(jìn)行質(zhì)量分析研究。雷公藤醇提物口服灌胃一次給藥，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠毒性反應(yīng)情況。
　　 結(jié)果：本課題所用雷公藤中總二萜內(nèi)酯的含量為0.0839‰～0.0859‰，雷公藤甲素的含量為0.0507‰～0.0525‰。雷公藤醇提物的LD50為5.6 g/kg，其95％的可信區(qū)間為4.8～6.4 g/kg。
　　 第二部分雷公藤醇提物對骨髓細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　

4、方法：體外培養(yǎng)大鼠股骨骨髓細(xì)胞，經(jīng)不同濃度的雷公藤醇提物作用后，采用MTT比色法檢測對骨髓細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀PI單標(biāo)法檢測對骨髓細(xì)胞周期的影響；采用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測對骨髓細(xì)胞凋亡的影響；采用紫外-可見分光光度法檢測對骨髓細(xì)胞caspase3、caspase8和caspase9酶活性的影響；采用ELISA法檢測對骨髓細(xì)胞培養(yǎng)液上清中GM-CSF、EPO、TPO三種細(xì)胞因子的影響。
　

5、　 結(jié)果：雷公藤醇提物可明顯抑制正常骨髓細(xì)胞增殖，并且此抑制作用呈明顯的時間和劑量依賴性，在作用24，48，72 h后，IC50分別為8.742，5.106，4.684μg/mL。細(xì)胞周期進(jìn)程的結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，雷公藤組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著減少，細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低，表明雷公藤醇提物阻滯骨髓細(xì)胞于G0/G1期。骨髓細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，雷公藤醇提物可引起骨髓細(xì)胞產(chǎn)生明顯的

6、凋亡，且隨著雷公藤濃度的增加，早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)占細(xì)胞總數(shù)的比例也不斷增加，說明雷公藤醇提物具有誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞凋亡的作用。對骨髓細(xì)胞caspase3、caspase8和caspase9酶活性的影響結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，雷公藤醇提物組caspase3和caspase9的活性顯著升高(P<0.01)，caspase8的活性無顯著性差異，說明雷公藤醇提物可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞凋亡。對骨髓細(xì)胞培養(yǎng)液上清中G

7、M-CSF、EPO、TPO三種細(xì)胞因子的影響結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，雷公藤醇提物組GM-CSF、EPO、TPO含量顯著降低(P<0.01)。
　　 第三部分中藥復(fù)方含藥血清對雷公藤醇提物致骨髓細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
　　 方法：體外培養(yǎng)大鼠股骨骨髓細(xì)胞，經(jīng)雷公藤醇提物(8μg/mL)作用后，加入5％、10％、15％、20％的六味地黃丸、金匱腎氣丸和歸脾丸含藥血清，采用MTT比色法檢測對骨髓細(xì)胞增殖的影響。對實驗中顯示促增

8、殖作用明顯的金匱腎氣丸進(jìn)行進(jìn)一步研究，采用流式細(xì)胞儀PI單標(biāo)法檢測對骨髓細(xì)胞周期的影響；采用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測對骨髓細(xì)胞凋亡率的影響；采用紫外-可見分光光度法檢測對骨髓細(xì)胞caspase3、caspase8和caspase9酶活性的影響；采用ELISA法檢測對骨髓細(xì)胞培養(yǎng)液上清中GM-CSF、EPO、TPO三種細(xì)胞因子的影響。
　　 結(jié)果：對骨髓細(xì)胞存活率的影響結(jié)果顯示，與模型對照組比較，六味

9、地黃丸、金匱腎氣丸、歸脾丸含藥血清均能顯著升高骨髓細(xì)胞的存活率，以金匱腎氣丸含藥血清的效果最佳。對細(xì)胞周期進(jìn)程影響的結(jié)果顯示，當(dāng)血清濃度為5％、10％、15％、20％時，與模型對照組比較，金匱腎氣丸含藥血清能顯著升高骨髓細(xì)胞增殖指數(shù)(P<0.05或P<0.01)，說明一定濃度的金匱腎氣丸含藥血清可促使骨髓細(xì)胞解除G0/G1期阻滯，由G0/G1期進(jìn)入S期以及由S期向G2/M期轉(zhuǎn)化，從而有利于骨髓細(xì)胞的增殖。對骨髓細(xì)胞凋亡影響的結(jié)果顯示，與

10、模型對照組比較，當(dāng)血清濃度為10％、15％、20％時，金匱腎氣丸組凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，說明金匱腎氣丸含藥血清對雷公藤醇提物所致的骨髓細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。對骨髓細(xì)胞caspase3、caspase8和caspase9酶活性的影響結(jié)果顯示，與模型對照組比較，當(dāng)血清濃度為15％、20％時，金匱腎氣丸組caspase3、caspase9活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)，caspase8活性未見明顯改變，說明

11、金匱腎氣丸含藥血清可能通過抑制線粒體途徑而減少骨髓細(xì)胞凋亡。對骨髓細(xì)胞培養(yǎng)液上清中GM-CSF、EPO、TPO三種細(xì)胞因子的影響結(jié)果顯示，與模型對照組比較，金匱腎氣丸組GM-CSF、EPO、TPO的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本課題所用雷公藤藥材中總二萜內(nèi)酯的含量為0.0839‰～0.0859‰，雷公藤甲素的含量為0.0507‰～0.0525‰。
　　 2.雷公藤醇提物的

12、LD50為5.6 g/kg，95％的可信區(qū)間為4.8～6.4 g/kg，肝臟為其急性毒性作用的主要靶器官之一。
　　 3.雷公藤醇提物可明顯抑制正常骨髓細(xì)胞增殖，具有時間和濃度依賴性，同時，使骨髓細(xì)胞阻滯于G0/G1期，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的作用可能是通過激活線粒體途徑實現(xiàn)的；雷公藤醇提物對骨髓細(xì)胞的抑制作用還可能與骨髓造血微環(huán)境中細(xì)胞因子的含量下降有關(guān)。
　　 4.中藥復(fù)方含藥血清能顯著增加雷公藤醇提物作用后骨