四逆散含藥血清對抗大鼠肝干細胞氧化損傷并誘導其分化的作用機制研究.pdf

1、目的:分析四逆散及含藥血清中藥物成分，確定其體內外物質基礎，研究四逆散含藥血清對肝干細胞的增殖、抗氧化損傷、誘導分化作用及機制，探索四逆散在肝病治療中的可能機理，為四逆散更好地臨床應用提供科學依據(jù)。
　　方法:采用HPLC-MS-MS法，梯度洗脫，測定四逆散及血清中有效成分，色譜條件:Betasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動相A∶水，B∶乙腈，流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，質譜采用ESI源全

2、離子掃描方式，負離子檢測，在m/z100-1200范圍內進行掃描，通過相對分子質量、質譜數(shù)據(jù)及相關信息確定四逆散水提物體外成分與血中物質基礎;用含藥血清作用WB-F344細胞24、48、72 h后，CCK-8方法檢測細胞活性;用100μmol/L H2O2處理40 min后，加四逆散含藥血清作用24 h，CCK-8方法檢測細胞活性，DCFH-DA染色、丙二醛(Methane Dicarboxylic Aldehyde，MDA)試劑盒檢測

3、細胞ROS含量及MDA含量，Hoechst33342染色觀察細胞核的變化，Annexin-V/PI雙染檢測細胞凋亡率，并分析蛋白Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平，觀察含藥血清抗氧化損傷情況;Western blot法檢測甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、白蛋白(albumin，ALB)、角蛋白-19(Cytokeratin-19，CK-19)、細胞色素P4501A1、2B1、3A(CYP1A1，CYP2

4、B1，CYP3A)的表達，免疫熒光法定位觀察AFP、ALB在細胞中的變化，RT-PCR檢測AFP、ALB的mRNA水平，Elisa試劑盒檢測細胞上清液中AFP、ALB的水平，Mito Tracker Red染色法檢測線粒體數(shù)目，JC-1染色檢測線粒體膜電位，Clark氧電極檢測細胞耗氧量，DCFH-DA染色檢測細胞內活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)生成，PAS法檢測糖原合成功能，尿素氮檢測試劑盒觀察尿素氮合

5、成功能，研究四逆散含藥血清對肝干細胞分化作用及細胞功能的影響;Western blot觀察表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)、成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor，F(xiàn)GFR)、轉化生長因子β受體Ⅰ型（Transforming Growth Factor beta Receptor typeⅠ，TGF-βRⅠ）、肝細胞生長因子

6、受體(Hepatocyte Growth Factor Receptor，HGFR)、蛋白表達情況，觀察四逆散含藥血清誘導肝干細胞分化機制是否與EGFR、HGFR等細胞因子受體有關;血糖試紙檢測細胞葡萄糖的消耗量，乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)檢測試劑盒檢測LDH、PK活性，乳酸、丙酮酸測定試劑盒檢測乳酸、丙酮酸含量，熒光素酶法測定細胞內ATP含量，分析

7、含藥血清對糖代謝的影響。
　　結果:在四逆散水提物中，檢測到甘草苷、橙皮苷、柚皮苷、柴胡皂苷a等成分，在四逆散血清中，檢測到芍藥苷、橙皮苷等成分以原型入血，還檢測到橙皮素葡萄糖醛酸等部分代謝物。含藥血清對細胞無毒性作用;10％含藥血清具有抗H2O2引起的細胞損傷作用，降低受損細胞中ROS的含量，降低細胞MDA水平，降低細胞凋亡率;同時，10％含藥血清顯示出較好的促進細胞增殖及分化的效果，肝干細胞分化標志物AFP的蛋白及基因水平有降

8、低趨勢，ALB的蛋白及基因水平有升高趨勢，CK-19蛋白水平無明顯改變;線粒體數(shù)目、膜電位、耗氧率、ROS都有一定程度增加;糖原合成功能、尿素氮合成功能提高，CYP3A蛋白水平有一定增加，CYP1A2，2B1蛋白水平無明顯改變;含藥血清作用細胞后，EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR蛋白表達水平上升，細胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、LDH活性降低，PK活性、丙酮酸含量、ATP含量上升。
　　結論:四逆散含藥血清能夠促進肝干細