納米金顆粒對肺癌細(xì)胞的放療增敏作用及機(jī)制的實驗研究.pdf

1、第一部分納米金顆粒的制備及其檢測
　　 目的:
　　 制備符合實驗要求的并具有腫瘤靶向作用的納米金顆粒，用于肺癌體外放射治療的研究。
　　 材料與方法:
　　 1.該實驗在納米金顆粒的制備中采用了經(jīng)典的水相氧化還原法，即以高價金離子（四氯金酸HAuCl4）為原材料，在特定的嚴(yán)格的條件下（溫度140℃左右，磁子攪拌速度300rpm），在其水溶液中加入還原劑檸檬酸三鈉，金離子被還原成金原子(Au)，并聚集成納

2、米顆粒(GNPs)。根據(jù)實驗需要，在合成后的GNPs的水溶液中加入一定濃度的巰基葡萄糖(Glu)溶液，常溫下靜置24小時，使其與GNPs充分結(jié)合，從而形成最終所需的結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定的巰基葡萄糖-納米金顆粒(Glu-GNPs)。
　　 2.合成后的GNPs通過透射電子顯微鏡(TEM)和動態(tài)光散射(DLS)觀察并分析其形態(tài)、分布及大小;利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測定其濃度;利用X射線光電子能譜分析(XPS)檢測巰葡

3、萄糖是否與納米金顆粒結(jié)合，并利用由此得到的各項參數(shù)計算出Glu-GNPs中金元素與硫元素的數(shù)目的比值，即可代表每個納米金顆粒所攜帶的巰基葡萄糖分子的個數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 TEM可見實驗中合成的納米金顆粒大小均勻，分散性良好。通過Origin分析軟件計算其直徑約為13±2.2nm;DLS測定其直徑約為15±1.8nm。兩者之間存在的差異原因是TEM所觀察的是烘干后的納米金顆粒，測量的是納米金顆粒核心的直徑，而DLS檢

4、測時將納米金顆粒外周的水膜計算在內(nèi)。ICP-AES測定制備的納米金顆粒溶液的濃度為36.9μg/ml。XPS數(shù)據(jù)顯示巰基葡萄糖與GNPs成功結(jié)合，并且計算得出每個納米金顆粒攜帶約2.3×104個巰基葡萄糖分子。
　　 結(jié)論:
　　 通過多方面嚴(yán)格的檢測，本實驗成功地合成符合要求的大小均勻（約15nm）、分散性良好、性質(zhì)穩(wěn)定的納米金顆粒，并且成功將巰基葡萄糖分子穩(wěn)定地偶聯(lián)在納米金顆粒的表面，合成實驗最終所需的具有腫瘤靶向作

5、用的Glu-GNPs。
　　 關(guān)鍵詞:四氯金酸;水相氧化還原法;納米金顆粒;巰基葡萄糖
　　 第二部分納米金對A549細(xì)胞的放療增敏作用及其機(jī)制
　　 目的:
　　 研究A549細(xì)胞對裸GNPs(未偶聯(lián)葡萄糖的納米金顆粒，以下均簡稱為GNPs)及Glu-GNPs的攝取;Glu-GNPs在A549細(xì)胞內(nèi)的分布;MTT實驗檢測Glu-GNPs對細(xì)胞的毒性作用;MTT實驗及克隆形成實驗觀察Glu-GNPs對A5

6、49細(xì)胞的放療增敏作用;利用流氏細(xì)胞技術(shù)檢測Glu-GNPs對A549細(xì)胞周期分布的影響及細(xì)胞凋亡的變化;利用Westernblot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從分子水平進(jìn)一步探索Glu-GNPs增加A549細(xì)胞對放射治療敏感性的機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 1.將一定濃度的Glu-GNPs加入對數(shù)生長巾的A549細(xì)胞中，培養(yǎng)24小時后，離心收集細(xì)胞，制備石蠟切片，在TEM下觀察Glu-GNPs在細(xì)胞內(nèi)的分布;

7、>　　 2.培養(yǎng)A549細(xì)胞，分為對照組、GNPs組及Glu-GNPs組，藥物濃度為5nM。分別于培養(yǎng)后不同時間(6h，12h，24h，48h)收集細(xì)胞并計數(shù)，硝酸裂解細(xì)胞，ICP-AES測定溶液巾金元素的含量。以此計算A549細(xì)胞在不同時間點分別對GNPs及Glu-GNPs的攝取量;
　　 3.取處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，分別加入不同濃度(0nM，5nM，10nM，20nM)的Glu-GNPs，MTT實驗檢測細(xì)胞在培養(yǎng)不

8、同時間后(24h，48h，72h)的存活分?jǐn)?shù);
　　 4.將不同濃度(0nM，5nM，10nM，20nM)Glu-GNPs處理下的A549細(xì)胞置于6MVX線下照射，劑量為10Gy，用MTT的方法觀察與射線聯(lián)合后不同濃度的Glu-GNPs對A549細(xì)胞的放療增敏作用;
　　 5.將不同數(shù)目的A549細(xì)胞(50，200，400，1000，2000，5000)種植于6孔板中，濃度為20nM的Glu-GNPs作用24h后，更換培

9、養(yǎng)液，根據(jù)不同細(xì)胞數(shù)目分別給予不同的照射劑量(0Gy，2Gy，4Gy，6Gy，8Gy，10Gy)，培養(yǎng)2周，待細(xì)胞克隆形成后，數(shù)克隆數(shù)目并繪制細(xì)胞克隆形成曲線，從而觀察Glu-GNPs對A549細(xì)胞的放療增敏效應(yīng);
　　 6.取對數(shù)生長的A549細(xì)胞，分為對照組，單純加藥組(20nMGlu-GNPs)，照射組(IR)及聯(lián)合組(Glu-GNPs+IR)，處理后收集細(xì)胞，PI染色，流氏細(xì)胞儀檢測各處理組細(xì)胞周期分布的變化;
　

10、　 7.取對數(shù)生長的A549細(xì)胞，分為對照組，單純加藥組(20nMGlu-GNPs)，照射組(IR)及聯(lián)合組(Glu-GNPs+IR)，處理后收集細(xì)胞，Annexin(V)及PI染色，流氏細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡的變化;
　　 8.取對數(shù)生長的A549細(xì)胞，分為對照組，單純加藥組(20nMGlu-GNPs)，照射組(IR)及聯(lián)合組(Glu-GNPs+IR)，處理后收集細(xì)胞，蛋白提取并變性，利用Westernblot技術(shù)檢測各組細(xì)

11、胞凋亡相關(guān)蛋白，包括Bcl-2，Bax及cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.TEM下可見Glu-GNPs主要分布于A549細(xì)胞的細(xì)胞漿巾，并呈聚集狀態(tài)附著于胞漿內(nèi)有膜細(xì)胞器—溶酶體或內(nèi)涵體的表面，;
　　 2.A549細(xì)胞對GNPs及Glu-GNPs的攝取在培養(yǎng)24小時均達(dá)到高峰，并且在任一所選取的時間點（6h除外），對Glu-GNPs的攝取量要明顯多于GNPs(P＜0.05

12、)。
　　 3.隨著Glu-GNPs的濃度的增加及時間的遞增，A549細(xì)胞的存活率未受到明顯的抑制（P＞0.05）;
　　 4.在一定的照射劑量下，A549細(xì)胞的存活率隨著Glu-GNPs濃度的增加而降低（P＜0.05），與濃度呈負(fù)相關(guān);
　　 5.細(xì)胞克隆實驗表明，在一定的Glu-GNPs濃度下，Glu-GNPs+IR組的Dq、D0及SF2均明顯低于IR組（P＜0.05），SER為1.49。Glu-GNPs可以

13、明顯提高A549細(xì)胞的放療敏感性;
　　 6.流氏細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期的結(jié)果顯示聯(lián)合組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例明顯高于單純照射組(P＜0.05)，Glu-GNPs可以將A549細(xì)胞阻滯在對放射較為敏感的G2/M期，提高其放射敏感性;
　　 7.流氏細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯高于單純照射組(P＜0.05)，Glu-GNPs可能通過提高放射線誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的凋亡來提高其放療敏感性;
　　 8

14、.Westernblot檢測結(jié)果顯示單純加藥組較對照組、聯(lián)合組較單純照射組，其細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)均呈下降趨勢，而Bax及cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá)均有所增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 根據(jù)腫瘤細(xì)胞對葡萄糖高代謝的特點，我們將葡萄糖分子利用巰基與納米金顆粒偶聯(lián)，從而使納米金顆粒更加準(zhǔn)確、有效地被A549細(xì)胞攝取。實驗結(jié)果表明，將巰基葡萄糖分子結(jié)合在GNPs的表面可以明顯提高A549細(xì)胞對

15、GNPs的攝取;細(xì)胞攝取Glu-GNPs后，主要呈聚集狀態(tài)分布于細(xì)胞漿內(nèi)有膜細(xì)胞器的表面，如內(nèi)涵體及溶酶體。Glu-GNPs在濃度低于20nM時對A549細(xì)胞的生長無明顯的抑制作用(P＞0.05)。Glu-GNPs能明顯提高A549細(xì)胞對6MVX射線的敏感性，其機(jī)制不僅涉及到細(xì)胞周期的改變，即G2/M期細(xì)胞比例的增加;而且Glu-GNPs增加了放射線誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的凋亡。Glu-GNPs對細(xì)胞凋亡的調(diào)控可能與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2蛋