索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG-,2-的放療增敏作用.pdf

1、研究的背景和目的： 肝癌是我國(guó)主要的惡性腫瘤，年發(fā)病率為10-150/10萬(wàn)人。在全世界也屬于常見(jiàn)病，每年新發(fā)原發(fā)性肝癌約26萬(wàn)例。我國(guó)每年死于肝癌約11萬(wàn)人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。大多數(shù)肝癌患者就診是已是中晚期，手術(shù)率僅有5％-10％左右。隨著放射治療設(shè)備與技術(shù)的發(fā)展，適形放療技術(shù)在臨床中的應(yīng)用，放射治療已逐漸成為非手術(shù)治療肝癌的主要方法之一。然而，由于肝癌細(xì)胞的相對(duì)輻射抗拒性，使得肝癌的根治劑量明顯高于肝臟的耐受劑量

2、，尤其中晚期肝癌多數(shù)有肝病基礎(chǔ)，又限制了放療劑量的提高，導(dǎo)致肝癌放療效果不佳。因此，如果能選擇可以增加肝癌細(xì)胞的輻射敏感性(Radiosensitivity)的藥物與放療聯(lián)合應(yīng)用，從而相對(duì)提高肝臟耐受劑量是提高中晚期肝癌療效的重要手段之一，在臨床應(yīng)用中具有重要的臨床價(jià)值。 放療增敏藥物的研究，一直都受到關(guān)注，早期研究的親電子類(lèi)的硝基化合物因毒性大而在臨床的應(yīng)用中受到限制。對(duì)放療增敏機(jī)制的進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與細(xì)胞

3、內(nèi)在的分子機(jī)制有關(guān)，因而對(duì)能特異性作用于腫瘤血管生成及信號(hào)傳導(dǎo)通路的分子靶向治療藥受到重視并成為研究熱點(diǎn)，相關(guān)的研究結(jié)果顯示了未來(lái)放療增敏的發(fā)展?jié)摿Α?分子靶向藥物是近來(lái)腫瘤內(nèi)科治療領(lǐng)域的重大進(jìn)展之一。并在一些腫瘤的治療中取得重大的突破。但分子靶向藥物與放療的聯(lián)合應(yīng)用，目前相關(guān)的研究報(bào)道不多。隨著對(duì)放射敏感基因的進(jìn)一步研究和認(rèn)識(shí)，分子靶點(diǎn)以及細(xì)胞信號(hào)通路與放射敏感性的關(guān)系也受到了較多的關(guān)注。有報(bào)道認(rèn)為細(xì)胞的P13K/Akt信號(hào)傳

4、導(dǎo)路徑在細(xì)胞放射敏感性的作用有非常重要的意義。而RAS/RAF/ERK信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系則是近來(lái)受到關(guān)注的另一條通路。近期的研究發(fā)現(xiàn)阻斷RAF-1或其介導(dǎo)的信號(hào)通路中其他信號(hào)分子位點(diǎn)，可以顯著提高部分輻射抵抗腫瘤的輻射敏感性。對(duì)于分子靶向藥物輻射增敏作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，有報(bào)道認(rèn)為分子靶向藥物輻射增敏作用的理論基礎(chǔ)與下列的機(jī)制相關(guān)：①抑制腫瘤細(xì)胞增殖和放射損傷的修復(fù)。腫瘤細(xì)胞受到輻射損傷后啟動(dòng)的損傷修復(fù)機(jī)制與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中

5、的許多關(guān)鍵靶分子相關(guān)，分子靶向藥可以通過(guò)對(duì)這些靶分子活性抑制而輻射增敏作用。②使腫瘤細(xì)胞周期再分布。③細(xì)胞毒作用或誘導(dǎo)凋亡作用。許多分子靶向藥物都具有直接或間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用使致克隆細(xì)胞數(shù)目減少，與放射聯(lián)合將發(fā)揮空間協(xié)同作用，從而提高放射的敏感性。④抑制腫瘤血管生成。主要針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF起作用。 甲苯磺酸索拉非尼片中文名又叫多吉美，是一種新型多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，是多激酶抑制劑(multi-kinaseinhibito

6、r)，其抗腫瘤作用機(jī)制為，一方面通過(guò)抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長(zhǎng)；另一方面通過(guò)抑制VEGF和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)受體而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。目前索拉非尼用于肝癌治療的3期臨床試驗(yàn)已經(jīng)于2006年底完成。除肝癌與腎癌外，最近國(guó)內(nèi)的一些研究還進(jìn)行了索拉非尼對(duì)肺腫瘤、前列腺癌、惡性黑色素瘤以及乳腺癌的治療作用的探索。國(guó)外的文獻(xiàn)中有關(guān)索拉非尼聯(lián)合化療對(duì)腎癌、結(jié)腸癌的治療已有一些報(bào)道

7、，但索拉非尼聯(lián)合放療對(duì)肝癌細(xì)胞作用的有關(guān)研究國(guó)內(nèi)外目前均還未見(jiàn)報(bào)道。因此設(shè)想用實(shí)驗(yàn)的方法觀察索拉非尼對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株HepG2的輻射增敏效應(yīng)。 方法： 1、用MTT實(shí)驗(yàn)觀察藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及殺傷作用，了解藥物不同濃度和作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞的抑制作用程度，IC50值，并初步觀察藥物的不同濃度作用下的細(xì)胞存活曲線(xiàn)。 2、細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)通過(guò)選擇合適的藥物濃度與不同放療劑量的聯(lián)合作用于細(xì)胞后觀察細(xì)胞的克隆形成集落

8、數(shù)量來(lái)觀察細(xì)胞的存活曲線(xiàn)，通過(guò)曲線(xiàn)的相關(guān)參數(shù)以及放射增敏比的比較來(lái)觀察藥物對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2的輻射增敏作用。 3、用PI染色法通過(guò)FCM檢測(cè)實(shí)驗(yàn)處理后的細(xì)胞周期分布變化；用AnnexinV-FITC標(biāo)記染色及PI染色的雙染方法并通過(guò)FCM檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)處理后的細(xì)胞凋亡率。初步探討索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞株。HepG2輻射增敏作用的相關(guān)機(jī)制。 結(jié)果： 1、MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示索拉非尼單獨(dú)使用時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞的具有抑制

9、作用，抑制作用程度與藥物濃度有關(guān)，還與作用時(shí)間有關(guān)，其作用3天、4天的IC50值分別為11.5ug/ml和8ug/ml。從細(xì)胞存活曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的看，其對(duì)細(xì)胞抑制作用的程度，是隨著藥物的濃度增加而增強(qiáng)，大致呈線(xiàn)性關(guān)系。從作用時(shí)間看，作用時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用的強(qiáng)度也加大。 2、細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用9ug/mlSorafenib對(duì)照射后HepG2細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)按線(xiàn)型二次模型擬合曲線(xiàn)，為向左下略帶弧度的曲線(xiàn)。對(duì)兩條曲線(xiàn)的參數(shù)(a

10、、β、a/β)進(jìn)行比較(均P<0.05)顯示出了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)存活分?jǐn)?shù)SF2比較，單純照射組為0.5125±0.0106，索拉非尼+照射組為0.4607±0.0094，經(jīng)兩樣本均數(shù)的比較，P=0.003(t=6.34，n=3)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對(duì)2.0Gy照射劑量水平的輻射增敏比的比較，索拉非尼藥物+照射組的SER為：1.3478±0.0758，與單純照射組的SER(1.1753±0.0055)比較，P=0.017(t=-3.928，n=

11、3)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2具有的輻射增敏作用。 3、HepG2細(xì)胞經(jīng)加或不加索拉非尼進(jìn)行6.0Gy照射處理后，細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示索拉非尼具有去周期阻滯的作用，加用索拉非尼后細(xì)胞被阻滯在G2/M期的比率與單純照射組比較明顯下降。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)則顯示，加用索拉非尼的照射組的凋亡率為：14.45±2.72比單純藥物(凋亡率為：10.37±2.28)或單純照射組(凋亡率10.06±1.

12、30的凋亡率明顯增加，方差分析(均P=0.008)顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，索拉非尼單獨(dú)作用于肝癌細(xì)胞株HepG2具有對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，其抑制的程度與藥物作用濃度有關(guān)系，隨藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。還與藥物的持續(xù)作用時(shí)間有關(guān)系，在2-5天的作用時(shí)間內(nèi)，隨藥物的作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的抑制作用也相應(yīng)增加。藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用與藥物的濃度類(lèi)似線(xiàn)性關(guān)系。 2、克隆形成率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，索