過氧化氫對人肝癌細胞株hepg2增殖的促進作用

1、<p>　　過氧化氫對人肝癌細胞株HepG2增殖的促進作用</p><p>　　作者：李成剛，高志清，劉瑞，梁欣，海春旭 </p><p>　　【關鍵詞】 過氧化氫 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To study the role of low concentration of H2O2 in promoting the pro

2、liferation of HepG2 cells so as to examine the role of NFκB and cell cycle in that process. METHODS: HepG2 cells were stimulated directly by H2O2. HepG2 cells were previously treated by 20 μmol/L PDTC for 2 hours before

3、 they were treated by 50 μmol/L H2O2. HepG2 cells in various phases of cell cycle were treated by 50 μmol/L H2O2. The proliferation of HepG2 cells was detected by MTT assay. RESULTS: H2O2 of 50</p><p>　　【

4、Keywords】 hydrogen peroxide; HepG2 cells line; cell division; cell cycle </p><p>　　【摘要】 目的： 探討低劑量過氧化氫（H2O2）對人肝癌細胞株HepG2的促增殖作用及該作用與NFκB和細胞周期的關系. 方法： 不同劑量H2O2直接作用于培養(yǎng)的HepG2細胞；20 μmol/L NFκB抑制劑（PDTC）預處理細胞2 h,

5、50 μmol/L的H2O2作用HepG2細胞；50 μmol/L H2O2分別作用于G1, G2/M, S期細胞，MTT法測定細胞增殖活性. 結果： 50 μmol/L的H2O2具有明顯的促進HepG2細胞生長的作用，此作用可以被PDTC抑制；50 μmol/L的H2O2可以明顯的促進G1期HepG2細胞生長. 結論： 低劑量H2O2可誘導HepG2細胞增殖，該過程可能包含依賴NFκB的信號途徑的參與；H2O2誘導HepG2細

6、胞增殖在細胞周期的不同時相效應敏感性不同，主要誘導G1期細胞增殖. </p><p>　　【關鍵詞】 過氧化氫；HepG2細胞系；細胞分裂；細胞周期 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　近年來對于活性氧（reactive oxygen species, ROS）、自由基(free radicals, RF)對細胞

7、增殖作用的研究越來越多. 有研究表明，ROS不僅可以刺激正常細胞增殖、轉化，也可以刺激腫瘤細胞增殖［1-3］，它還可以通過參與信號途徑來促進細胞表達多種參與生理、病理過程所需要的分子［4］，且這種作用存在時間―效應關系和劑量―效應關系. 但對于外源性H2O2直接作用于腫瘤細胞，促進細胞增殖與啟動信號途徑和細胞敏感周期關系的研究還很少，我們通過H2O2作用于人肝癌細胞株HepG2，初步探討其促進腫瘤細胞增殖與NFκB途徑和細胞敏感時相的關

8、系. </p><p><b>　　1材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p><p>　　肝癌細胞株HepG2由第四軍醫(yī)大學病理學教研室惠贈；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；新生牛血清為鄭州佰安生物公司產品；H2O2為西安試劑廠產品，4℃避光保存；Thiazolyl B

9、lue, Dimethyl Sulfoxide （DMSO）, Pyrrolidine dithiocarbamate （PDTC） 、胸腺嘧啶核苷（TdR）均購自美國Sigma公司；970CRT熒光分光光度計由上海三科儀器有限公司生產，ZS2板式酶標儀為北京新風機電技術公司產品. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1細胞

10、培養(yǎng)HepG2細胞經2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代后，接種于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含100 mL/L新生牛血清、2 g/L NaHCO3、鏈霉素100 mg/L、青霉素10×104 u/L，置37℃，50 mL/L CO2及飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài). </p><p>　　1.2.2MTT比色法檢測細胞增殖活性取對數生長期HepG2細胞2.5 g/L胰蛋白酶消化，用

11、含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，調整細胞密度為5×107/L，以每孔200 μL接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后加入終濃度分別為0.1, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 1000 μmol/L的H2O2，另外設陰性對照孔并用單純培養(yǎng)基作空白孔. 細胞分別于H2O2處理1, 24和48 h后每孔加入5 g/L MTT 20 μL, 37℃孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液

12、，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使紫色結晶物充分溶解，用ZS2板式酶標儀，波長為492 nm，檢測各孔吸光度值. </p><p>　　1.2.3PDTC對H2O2促增殖作用的影響細胞接種方法同前，培養(yǎng)10 h后，每孔加入終濃度為20 μmol/L PDTC 2 h后，以終濃度為50 μmol/L的H2O2分別處理1, 24和48 h, MTT法檢測細胞增殖狀況，方法同前. </p>

13、<p>　　1.2.4TdR誘導細胞同步化取處于對數生長期的HepG2細胞，用終濃度為2.5 mmol/L的TdR分別同步化得到S, G2/M和G1期HepG2細胞，具體方法參照文獻［5］. </p><p>　　1.2.5H2O2對同步化細胞的作用取按上述方法所得S, G2/M和G1期細胞，用終濃度為50 μmol/L 的H2O2分別作用1, 24, 48 h, MTT法檢測增殖效果，方法同前.

14、</p><p>　　統(tǒng)計學處理： 實驗數據以x±s表示，采用方差分析比較組間差異，組間差別的多重比較采用Dunnettt檢驗方法. 數據處理采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行. </p><p><b>　　2結果 </b></p><p>　　2.1不同劑量H2O2對HepG2細胞的作用實驗結果顯示，50 μmol/L終濃度的H2O

15、2作用細胞24 h后，吸光度值與對照組相比顯著升高（P&lt;0.01）；1 mmol/L H2O2作用細胞1 h后，吸光度值與對照組相比明顯降低（P&lt;0.05, Fig 1）. </p><p>　　2.2PDTC對H2O2促增殖作用的抑制作用20 μmol/L PDTC預處理細胞2 h后，給予50 μmol/L H2O2作用細胞，吸光度值與對照組相比無顯著性差異（P&gt;0.0

16、5），而單獨給予50 μmol/L H2O2作用細胞24 h，吸光度值與對照組相比顯著升高（P&lt;0.01, Fig 2）. </p><p>　　2.3H2O2對同步化HepG2細胞的作用50 μmol/L H2O2作用G1期細胞后，與對照組相比，吸光度值顯著升高（P&lt;0.05），而50 μmol/L H2O2作用S, G2/M期細胞后，光吸收值與對照組相比，無顯著性差異（Tab 1）

17、.表150 μmol/L H2O2對不同時相HepG2細胞增殖的影響（略） </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　活性氧、自由基是體內一系列重要的生物活性分子，參與多種生理、病理過程［6，7］. 細胞信號途徑可以被諸如活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等間接啟動，或是直接由質膜與刺激因素接觸并被上皮細胞或是間質細胞攝取. 細胞信號級聯(lián)反應

18、可以引起氧化還原敏感轉錄因子、NFκB, AP1的活化，這些轉錄因子的活化可能與控制細胞發(fā)生增殖反應有關［8］. 許多研究表明，細胞增殖是通過包含以ROS作為信號分子在內的信號途徑的調控來實現的［9］，并且一些刺激細胞在發(fā)生增殖反應的過程中，ROS作為信號分子是必需的. 外源性活性氧信號和細胞內源性活性氧信號都參與了促進細胞增殖的過程［10］，而且許多證據表明氧化信號刺激細胞增殖部分是通過活化NFκB來實現的［11］. </p&g

19、t;<p>　　NFκB已被證明是調節(jié)細胞生長的一種主要物質［12］，一般情況下NFκB與抑制分子IκB結合以非活化形式存在于細胞質中. 當NFκB被H2O2等刺激活化后，IκB發(fā)生磷酸化和泛素化，繼而降解而與NFκB解離，由p50和p65兩個亞基組成的NFκB二聚體從細胞質快速轉移至細胞核中［13］，該過程涉及到參與細胞增殖、凋亡和遷移有關基因的表達，并受到氧化/還原過程的調控. ROS對NFκB的活化可能是必需的，內源

20、性H2O2引起向核內轉移的p65增多，并伴有NFκBDNA結合物及反式激活的基因數量減少，同時氧化應激本身也可以促進NFκB由胞質向核內轉移. </p><p>　　本實驗利用MTT比色法檢測了H2O2對HepG2細胞的促增殖作用，結果顯示50 μmol/L終濃度的H2O2作用HepG2細胞后，吸光度值與對照組相比顯著升高，提示50 μmol/L終濃度的H2O2促進了該腫瘤細胞發(fā)生增殖反應；20 μmol/L P

21、DTC預處理組細胞與對照組相比，吸光度值有所升高，但無顯著性差異，提示H2O2的促腫瘤細胞增殖作用可以被NFκB抑制劑部分抑制，間接說明了H2O2促進腫瘤細胞增殖的過程中有包括NFκB途徑的參與. 與此同時，1 mmol/L H2O2處理組與對照組相比，1 h后吸光度值已顯著降低，提示高濃度H2O2損傷細胞時存在瞬時效應. </p><p>　　以往研究發(fā)現中濃度的H2O2作用可引起腫瘤細胞發(fā)生凋亡，并且這種作用

22、與細胞敏感時相有關［5］. 基于這些結果，我們探討了低劑量H2O2促腫瘤細胞增殖作用與細胞周期的關系. 實驗結果顯示，用50 μmol/L H2O2作用于同步化G1期細胞后，與對照組相比，光吸收值顯著升高，提示H2O2對該期細胞具有促增殖作用，而50 μmol/L H2O2作用于同步化S, G2/M期細胞后，吸光度值與對照組相比無顯著變化，提示G1期為H2O2發(fā)揮促增殖作用的主要時期. 因此，H2O2促進腫瘤細胞增殖可能與細胞敏感時相有

23、關，其作用機制有待進一步探討. </p><p><b>　　【參考文獻】 </b></p><p>　?。?］ 李蕓，廖鋼陵，鄧建籽，等. 超氧陰離子自由基促肝卵圓細胞株WBF344增殖、轉化作用的研究 </p><p>　?。跩］. 中國醫(yī)學科學院學報，2000；22（2）：106-110. </p><p>　　

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