過(guò)氧化氫對(duì)人肝癌細(xì)胞株hepg2增殖的促進(jìn)作用

1、<p>　　過(guò)氧化氫對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的促進(jìn)作用</p><p>　　作者：李成剛，高志清，劉瑞，梁欣，海春旭 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 過(guò)氧化氫 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To study the role of low concentration of H2O2 in promoting the pro

2、liferation of HepG2 cells so as to examine the role of NFκB and cell cycle in that process. METHODS: HepG2 cells were stimulated directly by H2O2. HepG2 cells were previously treated by 20 μmol/L PDTC for 2 hours before

3、 they were treated by 50 μmol/L H2O2. HepG2 cells in various phases of cell cycle were treated by 50 μmol/L H2O2. The proliferation of HepG2 cells was detected by MTT assay. RESULTS: H2O2 of 50</p><p>　　【

4、Keywords】 hydrogen peroxide; HepG2 cells line; cell division; cell cycle </p><p>　　【摘要】 目的： 探討低劑量過(guò)氧化氫（H2O2）對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的促增殖作用及該作用與NFκB和細(xì)胞周期的關(guān)系. 方法： 不同劑量H2O2直接作用于培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞；20 μmol/L NFκB抑制劑（PDTC）預(yù)處理細(xì)胞2 h,

5、50 μmol/L的H2O2作用HepG2細(xì)胞；50 μmol/L H2O2分別作用于G1, G2/M, S期細(xì)胞，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性. 結(jié)果： 50 μmol/L的H2O2具有明顯的促進(jìn)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，此作用可以被PDTC抑制；50 μmol/L的H2O2可以明顯的促進(jìn)G1期HepG2細(xì)胞生長(zhǎng). 結(jié)論： 低劑量H2O2可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖，該過(guò)程可能包含依賴NFκB的信號(hào)途徑的參與；H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)

6、胞增殖在細(xì)胞周期的不同時(shí)相效應(yīng)敏感性不同，主要誘導(dǎo)G1期細(xì)胞增殖. </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 過(guò)氧化氫；HepG2細(xì)胞系；細(xì)胞分裂；細(xì)胞周期 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　近年來(lái)對(duì)于活性氧（reactive oxygen species, ROS）、自由基(free radicals, RF)對(duì)細(xì)胞

7、增殖作用的研究越來(lái)越多. 有研究表明，ROS不僅可以刺激正常細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化，也可以刺激腫瘤細(xì)胞增殖［1-3］，它還可以通過(guò)參與信號(hào)途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)多種參與生理、病理過(guò)程所需要的分子［4］，且這種作用存在時(shí)間―效應(yīng)關(guān)系和劑量―效應(yīng)關(guān)系. 但對(duì)于外源性H2O2直接作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖與啟動(dòng)信號(hào)途徑和細(xì)胞敏感周期關(guān)系的研究還很少，我們通過(guò)H2O2作用于人肝癌細(xì)胞株HepG2，初步探討其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與NFκB途徑和細(xì)胞敏感時(shí)相的關(guān)

8、系. </p><p><b>　　1材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p><p>　　肝癌細(xì)胞株HepG2由第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室惠贈(zèng)；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；新生牛血清為鄭州佰安生物公司產(chǎn)品；H2O2為西安試劑廠產(chǎn)品，4℃避光保存；Thiazolyl B

9、lue, Dimethyl Sulfoxide （DMSO）, Pyrrolidine dithiocarbamate （PDTC） 、胸腺嘧啶核苷（TdR）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；970CRT熒光分光光度計(jì)由上海三科儀器有限公司生產(chǎn)，ZS2板式酶標(biāo)儀為北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司產(chǎn)品. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1細(xì)胞

10、培養(yǎng)HepG2細(xì)胞經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代后，接種于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含100 mL/L新生牛血清、2 g/L NaHCO3、鏈霉素100 mg/L、青霉素10×104 u/L，置37℃，50 mL/L CO2及飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài). </p><p>　　1.2.2MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞2.5 g/L胰蛋白酶消化，用

11、含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，以每孔200 μL接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后加入終濃度分別為0.1, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 1000 μmol/L的H2O2，另外設(shè)陰性對(duì)照孔并用單純培養(yǎng)基作空白孔. 細(xì)胞分別于H2O2處理1, 24和48 h后每孔加入5 g/L MTT 20 μL, 37℃孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液

12、，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使紫色結(jié)晶物充分溶解，用ZS2板式酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)為492 nm，檢測(cè)各孔吸光度值. </p><p>　　1.2.3PDTC對(duì)H2O2促增殖作用的影響細(xì)胞接種方法同前，培養(yǎng)10 h后，每孔加入終濃度為20 μmol/L PDTC 2 h后，以終濃度為50 μmol/L的H2O2分別處理1, 24和48 h, MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況，方法同前. </p>

13、<p>　　1.2.4TdR誘導(dǎo)細(xì)胞同步化取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用終濃度為2.5 mmol/L的TdR分別同步化得到S, G2/M和G1期HepG2細(xì)胞，具體方法參照文獻(xiàn)［5］. </p><p>　　1.2.5H2O2對(duì)同步化細(xì)胞的作用取按上述方法所得S, G2/M和G1期細(xì)胞，用終濃度為50 μmol/L 的H2O2分別作用1, 24, 48 h, MTT法檢測(cè)增殖效果，方法同前.

14、</p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用方差分析比較組間差異，組間差別的多重比較采用Dunnettt檢驗(yàn)方法. 數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行. </p><p><b>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　2.1不同劑量H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50 μmol/L終濃度的H2O

15、2作用細(xì)胞24 h后，吸光度值與對(duì)照組相比顯著升高（P&lt;0.01）；1 mmol/L H2O2作用細(xì)胞1 h后，吸光度值與對(duì)照組相比明顯降低（P&lt;0.05, Fig 1）. </p><p>　　2.2PDTC對(duì)H2O2促增殖作用的抑制作用20 μmol/L PDTC預(yù)處理細(xì)胞2 h后，給予50 μmol/L H2O2作用細(xì)胞，吸光度值與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P&gt;0.0

16、5），而單獨(dú)給予50 μmol/L H2O2作用細(xì)胞24 h，吸光度值與對(duì)照組相比顯著升高（P&lt;0.01, Fig 2）. </p><p>　　2.3H2O2對(duì)同步化HepG2細(xì)胞的作用50 μmol/L H2O2作用G1期細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，吸光度值顯著升高（P&lt;0.05），而50 μmol/L H2O2作用S, G2/M期細(xì)胞后，光吸收值與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（Tab 1）

17、.表150 μmol/L H2O2對(duì)不同時(shí)相HepG2細(xì)胞增殖的影響（略） </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　活性氧、自由基是體內(nèi)一系列重要的生物活性分子，參與多種生理、病理過(guò)程［6，7］. 細(xì)胞信號(hào)途徑可以被諸如活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等間接啟動(dòng)，或是直接由質(zhì)膜與刺激因素接觸并被上皮細(xì)胞或是間質(zhì)細(xì)胞攝取. 細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)

18、可以引起氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子、NFκB, AP1的活化，這些轉(zhuǎn)錄因子的活化可能與控制細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)有關(guān)［8］. 許多研究表明，細(xì)胞增殖是通過(guò)包含以ROS作為信號(hào)分子在內(nèi)的信號(hào)途徑的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的［9］，并且一些刺激細(xì)胞在發(fā)生增殖反應(yīng)的過(guò)程中，ROS作為信號(hào)分子是必需的. 外源性活性氧信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)源性活性氧信號(hào)都參與了促進(jìn)細(xì)胞增殖的過(guò)程［10］，而且許多證據(jù)表明氧化信號(hào)刺激細(xì)胞增殖部分是通過(guò)活化NFκB來(lái)實(shí)現(xiàn)的［11］. </p&g

19、t;<p>　　NFκB已被證明是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的一種主要物質(zhì)［12］，一般情況下NFκB與抑制分子IκB結(jié)合以非活化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中. 當(dāng)NFκB被H2O2等刺激活化后，IκB發(fā)生磷酸化和泛素化，繼而降解而與NFκB解離，由p50和p65兩個(gè)亞基組成的NFκB二聚體從細(xì)胞質(zhì)快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中［13］，該過(guò)程涉及到參與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移有關(guān)基因的表達(dá)，并受到氧化/還原過(guò)程的調(diào)控. ROS對(duì)NFκB的活化可能是必需的，內(nèi)源

20、性H2O2引起向核內(nèi)轉(zhuǎn)移的p65增多，并伴有NFκBDNA結(jié)合物及反式激活的基因數(shù)量減少，同時(shí)氧化應(yīng)激本身也可以促進(jìn)NFκB由胞質(zhì)向核內(nèi)轉(zhuǎn)移. </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)利用MTT比色法檢測(cè)了H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞的促增殖作用，結(jié)果顯示50 μmol/L終濃度的H2O2作用HepG2細(xì)胞后，吸光度值與對(duì)照組相比顯著升高，提示50 μmol/L終濃度的H2O2促進(jìn)了該腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)；20 μmol/L P

21、DTC預(yù)處理組細(xì)胞與對(duì)照組相比，吸光度值有所升高，但無(wú)顯著性差異，提示H2O2的促腫瘤細(xì)胞增殖作用可以被NFκB抑制劑部分抑制，間接說(shuō)明了H2O2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的過(guò)程中有包括NFκB途徑的參與. 與此同時(shí)，1 mmol/L H2O2處理組與對(duì)照組相比，1 h后吸光度值已顯著降低，提示高濃度H2O2損傷細(xì)胞時(shí)存在瞬時(shí)效應(yīng). </p><p>　　以往研究發(fā)現(xiàn)中濃度的H2O2作用可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且這種作用

22、與細(xì)胞敏感時(shí)相有關(guān)［5］. 基于這些結(jié)果，我們探討了低劑量H2O2促腫瘤細(xì)胞增殖作用與細(xì)胞周期的關(guān)系. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用50 μmol/L H2O2作用于同步化G1期細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，光吸收值顯著升高，提示H2O2對(duì)該期細(xì)胞具有促增殖作用，而50 μmol/L H2O2作用于同步化S, G2/M期細(xì)胞后，吸光度值與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化，提示G1期為H2O2發(fā)揮促增殖作用的主要時(shí)期. 因此，H2O2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞敏感時(shí)相有

23、關(guān)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討. </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　　［1］ 李蕓，廖鋼陵，鄧建籽，等. 超氧陰離子自由基促肝卵圓細(xì)胞株WBF344增殖、轉(zhuǎn)化作用的研究 </p><p>　　［J］. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2000；22（2）：106-110. </p><p>　　

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