白藜蘆醇苷對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株凋亡的促進(jìn)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　白藜蘆醇苷(Polydatin，PD)是從蓼科蓼屬虎杖(Polygonum Cuspidatum)的干燥根莖中提取的第4種單體，故又名虎杖結(jié)晶4號(hào)，也稱為虎杖苷。同時(shí)，在葡萄和葡萄酒中也存在大量的白藜蘆醇苷。近年來，國內(nèi)外對(duì)白藜蘆醇苷的研究表明:白藜蘆醇苷在抗血小板聚集、抗血栓形成、加強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮和舒張功能、改善休克之后重要組織器官的微循環(huán)等方面具有顯著效果。此外，還具有抗內(nèi)毒素休克性肺損傷、保護(hù)肝細(xì)胞、降血脂、抗脂

2、質(zhì)過氧化、減輕子宮內(nèi)膜異位癥引起的慢性疼痛及改善結(jié)腸炎等作用。白藜蘆醇苷為白藜蘆醇的衍生物，之前有大量的臨床研究表明，白藜蘆醇具有良好的腫瘤預(yù)防和腫瘤治療的作用。然而，對(duì)于自藜蘆醇苷是否具有良好的腫瘤預(yù)防與治療作用的研究目前才剛剛起步。已有人初步觀察了白藜蘆醇苷對(duì)小鼠移植性肝癌、艾氏腹水癌的作用，發(fā)現(xiàn)可抑制腫瘤的生長并引起G2/M期細(xì)胞周期阻滯[1]。本文的目的在于探討白藜蘆醇苷對(duì)肝癌細(xì)胞在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中是否具有增殖抑制作用，并進(jìn)一步認(rèn)識(shí)

3、白藜蘆醇苷對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡及運(yùn)動(dòng)能力的影響，為之后的臨床研究提供更廣泛的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　細(xì)胞凋亡是一種多發(fā)生于生理情況下細(xì)胞死亡現(xiàn)象，故稱為生理性死亡——凋亡(apoptosis)，又稱程序性死亡(programmed cell death，PCD)。其重要的特點(diǎn)是:細(xì)胞腫脹溶解并釋放出裂解產(chǎn)物，使周圍組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。1972年Kerr最先提出這一概念，細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物體的一種重要的自穩(wěn)機(jī)制。它可以主動(dòng)地清除多余的有特異性、

4、分化能力與機(jī)體不相適應(yīng)的以及已經(jīng)完成功能而又不再有用的細(xì)胞;清除有潛在危險(xiǎn)的細(xì)胞，如自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞及DNA損傷又得不到修復(fù)有癌變危險(xiǎn)的細(xì)胞等。故凋亡是調(diào)節(jié)生物體正常發(fā)育不可缺少的一種機(jī)制，此種調(diào)節(jié)一旦失敗會(huì)導(dǎo)致機(jī)體疾病，腫瘤的發(fā)生甚至死亡。腫瘤細(xì)胞屬于永生性細(xì)胞，腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡異常有關(guān)。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)以人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2為研究對(duì)象，通過采用2-(2-甲氧基-4-硝

5、苯基)-3-（4-硝苯基）-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽（Cell Counting Kit簡稱CCK試劑盒）試劑盒檢測不同濃度(12.5～200μmol/L)和不同作用時(shí)間(24、48、72h)處理人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞抑制率;倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察處理后的各組肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)的改變;流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)過不同濃度白藜蘆醇苷處理后，檢測分析各組細(xì)胞的凋亡率;通過粘附實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測白藜蘆醇苷對(duì)肝細(xì)胞癌

6、細(xì)胞侵襲能力的影響，并比較其對(duì)不同細(xì)胞株作用的差別;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析以及單因素方差分析，均數(shù)間多重比較采用LSD方法，方差不齊時(shí)采用Dunnet-t方法進(jìn)行;用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
　　結(jié)果:
　　1.白藜蘆醇苷抑制肝癌細(xì)胞的生長
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:白藜蘆醇苷在12.5～200μM濃度，作用時(shí)間24～72h范圍內(nèi)，處理肝癌細(xì)胞HepG2

7、，以濃度和時(shí)間依賴方式抑制HepG2細(xì)胞增殖(P＜0.05)，同時(shí)，白藜蘆醇苷的濃度在12.5μmol/L以上時(shí)，即可抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，濃度達(dá)到25μmol/L以上時(shí)，可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。
　　2.白藜蘆醇苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡
　　流式細(xì)胞儀分析顯示:經(jīng)過不同濃度的白藜蘆醇苷處理肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞后，在處理后24h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，并與對(duì)照組對(duì)比，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡比例隨著濃度的增加而明顯增多?？梢?/p>

8、，白藜蘆醇苷能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈濃度依賴性。
　　3.白藜蘆醇苷改變肝癌細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)
　　倒置顯微鏡下觀察:形態(tài)變化24h組已可見較明顯差異。對(duì)照組細(xì)胞飽滿呈梭形或多邊形貼壁生長良好，透光度好且細(xì)胞密度較大，僅有少量脫落漂浮于培養(yǎng)液的細(xì)胞。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長狀態(tài)明顯較對(duì)照組差，細(xì)胞皺縮，隨著濃度的增高，細(xì)胞存活越少，漂浮細(xì)胞增多。
　　Hoechest33342熒光染色顯示:用不同濃度的白藜蘆醇苷處理肝癌細(xì)胞He

9、pG2后，細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞體積縮小、變形，有凋亡小體形成，細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮、核碎裂和核溶解，細(xì)胞處于凋亡階段，在形態(tài)上與正常的細(xì)胞核區(qū)別明顯，呈濃度時(shí)間依賴性。
　　4.白藜蘆醇苷抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力
　　通過運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察表明:隨著白藜蘆醇苷的濃度和處理時(shí)間的增加，肝癌細(xì)胞HepG2侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯減弱，呈濃度時(shí)間依賴性。25μmol/L、50μmol/L的白藜蘆醇苷可抑制HepG2細(xì)胞(