ART逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼耐藥的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:建立肝癌對(duì)索拉非尼(Sorafenib)耐藥細(xì)胞株Bel-7402/Sora并初步探討青蒿琥酯(ART)逆轉(zhuǎn)其耐藥性的作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:1.通過MTT法測(cè)定Sorafenib對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402生長(zhǎng)抑制的影響，計(jì)算其半抑制濃度(IC50)。通過大劑量沖擊聯(lián)合持續(xù)低劑量濃度遞增的方法建立肝癌細(xì)胞Bel-7402耐藥株Bel-7402/Sora。顯微鏡下觀察肝癌細(xì)胞及耐藥株形態(tài)差異。MTT法測(cè)定肝癌耐藥細(xì)胞株I

2、C50及其耐藥倍數(shù)。Western-blot法檢測(cè)兩種細(xì)胞在給予不同濃度Sorafenib及蛋白GRP78和Beclin1的表達(dá)差異。
　　2.采用MTT法觀察不同濃度ART對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞株與親本細(xì)胞株的抑制作用，并計(jì)算出ART的無細(xì)胞毒性濃度。通過不同濃度的Sorafenib聯(lián)合無毒性濃度ART前后對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞株增殖的影響，計(jì)算其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)及相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率。Western-blot法檢測(cè)在給予不同濃度Sorafenib聯(lián)合無細(xì)胞毒

3、性濃度ART前后蛋白GRP78和Beclin1的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:1.光鏡下見Bel-7402細(xì)胞和Bel-7402/Sora細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，單層上皮樣分散排列。Bel-7402細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大小均衡，胞質(zhì)內(nèi)無空泡樣物質(zhì)，邊界整齊且呈梭形生長(zhǎng)。Bel-7402/Sora細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，大小不一，胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡樣物質(zhì)及顆粒，邊界不齊，聚集生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較正常細(xì)胞緩慢。
　　2.Sorafenib對(duì)于Bel-7402/So

4、ra細(xì)胞的24h IC50=37.7μmol/L，48h IC50=8.133μmol/L。綜合24h與48h耐藥及親本細(xì)胞IC50值變化，因細(xì)胞性狀等因素影響導(dǎo)致48h組無明顯意義，故本實(shí)驗(yàn)選取24h組為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組。Bel-7402/Sora相對(duì)于Bel-7402對(duì)Sora的耐藥指數(shù)為2.42。Bel-7402/Sora細(xì)胞中GRP78和Beclin1表達(dá)均上升。
　　3.無細(xì)胞毒性青蒿琥酯聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞Bel-74

5、02/Sora的24hIC50=11.93μmol/L。經(jīng)計(jì)算ART聯(lián)合索拉非尼作用于Bel-7402/Sora細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)指數(shù)為3.16，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為116％。青蒿琥酯聯(lián)合索拉非尼用于耐藥細(xì)胞Bel-7402/Sora中時(shí)GRP78和Beclin1表達(dá)均明顯降低。
　　結(jié)論:1.建立肝癌對(duì)索拉非尼耐藥細(xì)胞株Bel-7402/Sora，證明GRP78和Beclin1參與了細(xì)胞耐藥性的形成。
　　2.ART可通過降低蛋白GRP