索拉非尼聯(lián)合順鉑對人肝癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，隨著肝癌分子生物學(xué)的研究深入，分子靶向治療研究正逐漸成為肝癌治療的新手段。分子靶向治療藥物酪氨酸激酶抑制劑已經(jīng)在多種腫瘤的臨床試驗(yàn)中取得另人鼓舞的效果。其中多靶點(diǎn)藥物索拉非尼(Sorafenib，Nexavar，BAY43-9006)在晚期肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)的治療中取得確切的療效。 索拉非尼是一種口服的小分子激酶抑制劑，一項(xiàng)國際多中心III期隨機(jī)對照治療HCC的SHARP研

2、究結(jié)果顯示索拉非尼能延長晚期HCC患者的生存期。該研究結(jié)果被認(rèn)為是首次發(fā)現(xiàn)能延長HCC存活期的藥物，并認(rèn)為索拉非尼可視為晚期HCC的一線治療藥物。2007年11月，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)索拉非尼治療不能手術(shù)切除的HCC。 傳統(tǒng)化療藥物順鉑(Cisplatin，DDP)的抗腫瘤作用顯著，抗腫瘤活性強(qiáng)，抗腫瘤譜廣，臨床廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體瘤的治療。本研究旨在探討索拉非尼與DDP聯(lián)合對HCC的聯(lián)合抑制作用，并探討其可能機(jī)制，為肝癌的綜合治療

3、、提高療效提供理論基礎(chǔ)。 第一部分：索拉非尼聯(lián)合DDP對人肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究 一、材料與方法 1.HepG2細(xì)胞在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3-5天傳一次代，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用。 2.將細(xì)胞分成4組，分別為空白對照組、索拉非尼單藥組、DDP單藥組、索拉非尼聯(lián)合DDP組。檢測細(xì)胞增殖抑制率時索拉非尼藥物濃度分別為2、4、8、16μmol／L；DDP藥物濃度

4、分別為3、6、12、24μmol／L；索拉非尼聯(lián)合DDP組藥物濃度是2+3、4+6、8+12μmol／L。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、凋亡及Westem-blot檢測蛋白(ERK、pERK、CyclinD1及p21WAF1／CIP1蛋白)時，組中藥物濃度索拉非尼均為4μmol／L，DDP均為6μmol／L。 3.采取上述分組，用MTT法檢測藥物對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。 4.采用協(xié)同作用

5、q值判斷索拉非尼和DDP聯(lián)用的性質(zhì)：q>1.15為協(xié)同作用，0.85≤q≤1.15為相加作用，q<0.85為拮抗作用。 5.采取上述分組，收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡。 6.采取上述分組，收集細(xì)胞，提取蛋白行Western-blot檢測ERK、pERK、CyclinD1及p21WAF1/CIP1蛋白的表達(dá)。 7.統(tǒng)計(jì)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，各組

6、間細(xì)胞抑制率比較采用重復(fù)測量方差分析；細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率及蛋白表達(dá)IOD值采用單向方差分析；多重比較均采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05(雙側(cè))表示差異有顯著性。 二、結(jié)果 1.索拉非尼、DDP單藥對人肝癌HepG2細(xì)胞的生長抑制作用 經(jīng)MTT法檢測示，不同濃度索拉非尼對人肝癌均有抑制作用，隨濃度增高及時間延長抑制率增強(qiáng)(P均<0.001)。DDP對人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用亦具有時間及劑量依賴效應(yīng)(P均<0.0

7、01)。 2.索拉非尼和DDP不同濃度單獨(dú)及聯(lián)合對人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用 經(jīng)MTT法檢測示，各濃度單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞的抑制率有顯著性差異(P<0.001)；各濃度聯(lián)合組與相應(yīng)濃度索拉非尼或DDP單藥組相比，抑制率均有顯著性差異(P<0.001)，聯(lián)合組療效均優(yōu)于單藥組(P<0.001)。 3.索拉非尼和DDP不同濃度聯(lián)合作用的q值 索拉非尼2μmol／L和DDP3μmol/L聯(lián)合用藥組在24小時

8、未顯示出相加作用，48和72小時表現(xiàn)為相加作用。索拉非尼4μmol/L和DDP8μmol/L聯(lián)合用藥組在各個時間點(diǎn)均顯示相加作用(0.85≤q≤1.15)。索拉非尼8μnol／L和DDP12μmol／L聯(lián)合用藥組于24和48小時未出現(xiàn)相加作用，至72小時表現(xiàn)為相加作用。 4.索拉非尼、DDP單藥及聯(lián)合用藥對人肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期示，與對照組相比，索拉非尼及DDP單藥作用均可使細(xì)胞周期阻滯于

9、G0／G1期(P=0.002，0.032)。聯(lián)合用藥組G0／G1期細(xì)胞比率高于索拉非尼及DDP單藥組(P=0.025，0.002)，S期細(xì)胞比率低于單藥組(P=0.004，0.022)。 5.索拉非尼、DDP單藥及聯(lián)合用藥對人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用 索拉非尼或DDP單藥作用后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，細(xì)胞凋亡率均較對照組升高(P=0.006，0.036)。與索拉非尼(21.18％)和DDP(16.45％)單藥組相比，聯(lián)合用

10、藥組凋亡率升高更為明顯，達(dá)35.28％(P=0.007，0.001)。 6.索拉非尼、DDP單藥及聯(lián)合用藥對人肝癌HepG2細(xì)胞ERK及pERK蛋白表達(dá)的影響 Western-blot檢測結(jié)果示，單藥及聯(lián)合用藥組對HepG2細(xì)胞ERK總蛋白的表達(dá)無影響，而pERK蛋白在索拉非尼組及聯(lián)合用藥組的表達(dá)均較對照組降低(P<0.001)，以聯(lián)合組尤甚；DDP組與對照組條帶表達(dá)無差異(P=0.173)。 7.索拉非尼、DD

11、P單藥及聯(lián)合用藥對蛋白的影響 經(jīng)Western-blot檢測示，索拉非尼組和聯(lián)合組的CyclinD1條帶表達(dá)低于對照組(P<0.001，P=0.001)，DDP組和對照組條帶無顯著性差異(P=0.509)。對照組和索拉非尼組p21WAF1／CIP1蛋白的表達(dá)低；DDP組及聯(lián)合組條帶表達(dá)未見差異(P=0.734.)，兩者均較對照組表達(dá)增強(qiáng)(P=0.001)。 三、結(jié)論： 1.索拉非尼及DDP單藥對人肝癌HepG2細(xì)

12、胞都有增殖抑制作用。 2.索拉非尼與DDP聯(lián)用具有療效相加作用。 3.索拉非尼和DDP單藥或聯(lián)合能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及凋亡，以聯(lián)合時更顯著。 4.索拉非尼通過RAF／MEK／ERK途徑下調(diào)CyclinD1的表達(dá)，而DDP通過p53途徑上調(diào)的p21WAF1／CIP1蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯；與單藥相比，兩藥聯(lián)用從多個途徑引起細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了抗腫瘤效果。 第二部分：索拉非尼聯(lián)合DDP抑制人

13、肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究 一、材料與方法 1.建立人肝癌HepG2裸鼠移植瘤模型：0.2ml人肝癌HepG2細(xì)胞(對數(shù)生長期)懸液接種裸鼠，每只裸鼠注射部位為裸鼠右腋下部皮下，注射腫瘤細(xì)胞懸液(0.2ml／只)，含活細(xì)胞5×106／0.2ml。 2.實(shí)驗(yàn)分組：將已成瘤小鼠(瘤重約130-150mg)隨機(jī)分成空白對照組、溶劑對照組、索拉非尼組、DDP組和聯(lián)合用藥組共五組，每組10只。各組裸鼠于治療起第

14、21天處死。 3.給藥：索拉非尼組給予索拉非尼30mg／kg，胃管灌入0.1ml，每天一次，共12天。DDP組給予4mg／kg，腹腔注射0.2ml，每4天一次，共3次，聯(lián)合用藥組中索拉非尼給予30mg／kg，DDP給予4mg／kg，兩種藥物于同一天開始給藥，早上給予索拉非尼，下午給DDP，時間間隔為3-5小時。 4.裸鼠腫瘤大體形態(tài)觀察，并測定裸鼠體重、腫瘤大小及計(jì)算瘤重：每只裸鼠在給藥第1天開始測體重和腫瘤大小，每星期

15、測兩次。瘤重根據(jù)公式：(1×w2)／2，1指腫瘤的長徑；w指腫瘤的短徑。 5.療效及毒性評價：療效以完全緩解(completeremission，CR)、部分緩解(partialremission，PR)和腫瘤生長抑制(tumorgrowthinhibition，TGI)來評價。毒性評價：以超過20％裸鼠死亡和／或體重減輕(去除瘤重)超過20％稱為毒性大。 6.腫瘤組織HE染色并置于顯微鏡觀察。 7.統(tǒng)計(jì)處理：實(shí)

16、驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，各組腫瘤瘤重比較采用重復(fù)測量方差分析，多重比較均采用LSD檢驗(yàn)。P≤0.05(雙側(cè))表示差異有顯著性。 二、結(jié)果： 1.觀察裸鼠移植瘤大體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，各治療組腫瘤生長慢于對照組，以聯(lián)合組腫瘤生長最慢。治療后第21天處死的瘤體組織，對照組腫瘤體積最大，聯(lián)合用藥組腫瘤體積最小。切開腫瘤組織，對照組及DDP組腫瘤周邊組織血供較豐富，而索拉非尼組及聯(lián)合用藥

17、組小血管較少。 2.各治療組與對照組相比療效均有顯著性差異，P<0.001；聯(lián)合用藥組療效優(yōu)于索拉非尼及DDP單藥組(P=0.003，P<0.001)。 3.每組均未有超過20％的死亡率，體重亦未減少超過20％。溶劑對照組、DDP組及聯(lián)合用藥組各死亡1只，索拉非尼死亡2只。各組未出現(xiàn)CR，其中索拉非尼單藥組及聯(lián)合用藥組各出現(xiàn)1例PR。索拉非尼及DDP單藥的TGI分別為46.43％和38.45％，聯(lián)合用藥組TGI達(dá)60.4