索拉非尼聯(lián)合肝素-達(dá)肝素對(duì)腫瘤抑制作用的研究.pdf

1、我國(guó)是肝癌大國(guó)，全球每年新發(fā)肝癌病例有50％來(lái)自中國(guó)。許多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期，或治療后發(fā)生轉(zhuǎn)移，此時(shí)，手術(shù)、放療、介入都無(wú)能為力。本研究選擇分別針對(duì)腫瘤增殖本身和腫瘤微環(huán)境刺激因素的兩種作用機(jī)制不同的藥物，索拉非尼和肝素/達(dá)肝素，設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲性和血管生成的影響，以驗(yàn)證聯(lián)合用藥能夠增加療效的假設(shè)。 研究材料與方法： 主要試劑及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 索拉非尼(多吉美，甲苯磺酸索拉非尼片)用10％DMSO

2、溶解稀釋，然后以DMEM高糖培養(yǎng)基(H-DMEM)溶解至所需濃度。肝素，低分子量肝素達(dá)肝素(法安明，達(dá)肝素鈉注射液)以H—DMEM溶解至所需濃度。選擇高侵襲性肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HCCLM6作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。 MTT實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞系HCCLM6，胰酶消化后接種于96孔板，5×103個(gè)/孔，分別與不同濃度的索拉非尼、肝素、達(dá)肝素共同孵育72h(單藥組)，或不同濃度肝素/達(dá)肝素孵育24h后，加入一定濃度索拉非尼繼續(xù)孵育48h(聯(lián)

3、合用藥組)，然后加入MTT繼續(xù)孵育4h，DMSO溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定.490nm的OD值，與空白對(duì)照相比，計(jì)算細(xì)胞存活率。 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期及凋亡率的變化肝癌細(xì)胞HCCLM6每孔1×104個(gè)接種于6孔板，分別加入索拉非尼(4μmol/L)、或肝素/達(dá)肝素(10IU/ml)、或兩藥聯(lián)合，24h后收集細(xì)胞，PI染色后以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期；或同樣加藥方法，處理后AnnexinV-FITC及PI雙染，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

4、 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-ERK1/2及ERK1/2蛋白表達(dá)收集藥物作用后的細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行SDS/PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，依次加入一抗及二抗，與發(fā)光試劑溫浴后曝光、顯影和定影，進(jìn)行結(jié)果分析。 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)96孔培養(yǎng)板上鋪設(shè)Matrigel，接種HCCLM6細(xì)胞2×103個(gè)/孔，分別加入索拉非尼、肝素、達(dá)肝素及聯(lián)合藥物，1h后以蘇木素一伊紅染色基質(zhì)膜黏附細(xì)胞數(shù)，與空白對(duì)照相比，計(jì)算細(xì)胞黏附率。 細(xì)胞

5、侵襲實(shí)驗(yàn)在24孔Transwell上室鋪設(shè)Matrigel，使之在微孔濾膜上凝固為基底膜結(jié)構(gòu)，向上室接種HCCLM61×106個(gè)/孔，分別加入預(yù)設(shè)藥物，12h后Giemsa染色后計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，與空白對(duì)照相比，計(jì)算細(xì)胞侵襲率。 雞胚絨毛膜尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)8日齡胚蛋，隨機(jī)分組，每組10只分組加入索拉非尼、肝素、達(dá)肝素及聯(lián)合藥物，72h后計(jì)數(shù)CAM的血管數(shù)量。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行單方差分析(One

6、wayANOVA)，多重比較采用LSD方法，MTT實(shí)驗(yàn)不同濃度單藥組與對(duì)照組比較使用Dunnett方法，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，文中的數(shù)據(jù)表述如未加說(shuō)明均采用-x±SD格式。 結(jié)果： MTT實(shí)驗(yàn)鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞個(gè)體大，排列緊密，形狀不規(guī)則；索拉非尼組細(xì)胞密度依藥物濃度遞減，肝素/達(dá)肝素組細(xì)胞突起減少，細(xì)胞間距增大。MTT染色結(jié)果顯示各濃度索拉非尼細(xì)胞存活率較對(duì)照組細(xì)胞存活率顯著降低

7、(均P<0.05)，與肝素/達(dá)肝素聯(lián)用，細(xì)胞存活較各單藥組進(jìn)一步降低(均P=0.000)，達(dá)肝素對(duì)索拉非尼的增效作用大于相同濃度的肝素組(均P<0.05)。 細(xì)胞周期應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，各用藥方式對(duì)細(xì)胞G1期(F=1.619，P=0.229)和G2期(F=1.326，P=0.318)影響差異不顯著，對(duì)細(xì)胞S期的影響存在顯著差異(F=3.508，P=0.035)，索拉非尼及達(dá)肝素組較對(duì)照組S期細(xì)胞升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<

8、0.05)，肝素/達(dá)肝素對(duì)索拉非尼沒(méi)有顯著影響(均P>0.05)。 細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡，早期凋亡率：各用藥方式對(duì)細(xì)胞早期凋亡率的影響存在顯著差異(F=13.916，p=0.000)，單藥索拉非尼、肝素、達(dá)肝素較對(duì)照組顯著增高(均P<0.05)，肝素及達(dá)肝素單藥之間沒(méi)有顯著差異(P=0.427)，聯(lián)合組較單藥組顯著增高(均P<0.05)，肝素聯(lián)合索拉非尼與達(dá)肝素聯(lián)合索拉非尼之間沒(méi)有顯著差異(P=0.587)；晚期凋亡率

9、：各用藥方式對(duì)細(xì)胞晚期凋亡率的影響存在顯著差異(F=373.217，P=0.000)，與對(duì)照組相比較，索拉非尼組晚期凋亡率顯著增高(P=0.000)，肝素/達(dá)肝素晚期凋亡率與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(均P>0.05)；聯(lián)合用藥時(shí)，肝素/達(dá)肝素對(duì)索拉非尼沒(méi)有顯著增效作用(均P>0.05)。 免疫印跡實(shí)驗(yàn)ERK1/2的表達(dá)各組變化不明顯(F=1.302，P=0.326)，而p-ERK的表達(dá)在各組間差異顯著(F=47.011，p=0.000

10、)，用藥組均較對(duì)照組降低(均P<0.05)，聯(lián)合用藥組較各個(gè)單藥組又有一定程度的降低(均P<0.05)，肝素組與達(dá)肝素組p-ERK的表達(dá)差異不顯著(P<0.05) 黏附實(shí)驗(yàn)各用藥方式對(duì)細(xì)胞黏附率的影響存在顯著差異(F=149.871，P=0.000)，與對(duì)照組相比較，肝素/達(dá)肝素組腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)間黏附率顯著下降(均P=0.000)，肝素與達(dá)肝素之間沒(méi)有顯著差異(P=0.696)，而索拉非尼對(duì)細(xì)胞的黏附作用的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

11、=0.097)；聯(lián)合用藥組，索拉非尼無(wú)論對(duì)肝素還是達(dá)肝素都沒(méi)有顯著的增效作用(均P>0.05)。 侵襲實(shí)驗(yàn)各用藥方式對(duì)細(xì)胞侵襲率的影響存在顯著差異(F=78.773，p=0.000)，較對(duì)照組，索拉非尼、肝素/達(dá)肝素顯著抑制了細(xì)胞的侵襲能力(均P=0.000)，肝素及達(dá)肝素之間沒(méi)有顯著差異(P=0.336)；聯(lián)合用藥時(shí)，索拉非尼顯著增強(qiáng)了肝素及達(dá)肝素抑制細(xì)胞侵襲的作用(均P<0.05)，索拉非尼聯(lián)合肝素或達(dá)肝素之間沒(méi)有顯著差異(

12、P=0.391)。 CAM實(shí)驗(yàn)固定前觀察各組CAM血管，與對(duì)照組比較，索拉非尼組血管減少，可見(jiàn)大血管繞道行走和明顯的迂曲變形；肝素/達(dá)肝素組大血管增多，小血管明顯減少，血管變形少見(jiàn)；聯(lián)合用藥組血管進(jìn)一步減少，可見(jiàn)少量迂曲變形的血管。分析各組血管生成數(shù)量的差異，發(fā)現(xiàn)各用藥方式對(duì)血管數(shù)量的影響存在顯著差異(F=206.659，p=0.000)，添加藥物后各實(shí)驗(yàn)組的血管生成較對(duì)照組均顯著減少(均P=0.000)；肝素組、達(dá)肝素組間無(wú)統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)差異(P=0.447);聯(lián)合用藥各組較各單藥各組血管生成顯著減少(均P<0.05)，(索拉非尼+肝素)組與(索拉非尼+達(dá)肝素)組間的差異不顯著(P=0.633)。 討論: 隨著診療手段的進(jìn)步，肝癌患者的生存期大大延長(zhǎng)，伴隨而來(lái)的是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或治療后復(fù)發(fā)率的增加。肝癌的轉(zhuǎn)移越來(lái)越引起研究者們的重視。腫瘤的生長(zhǎng)和播散設(shè)計(jì)一系列的惡性生物學(xué)行為，如無(wú)限增殖、侵襲性、遠(yuǎn)處生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)紊亂、惡性血管增生等。在以往的研究中，我們把注

14、意力幾乎全部集中在腫瘤細(xì)胞本身。腫瘤微環(huán)境，即腫瘤細(xì)胞所處的環(huán)境，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等各方面起著重要的作用，腫瘤細(xì)胞之間以及與微環(huán)境各組分之間通過(guò)各種細(xì)胞因子及受體進(jìn)行交流。肝癌細(xì)胞的進(jìn)展同樣依靠與微環(huán)境之間的交流。針對(duì)這些相互作用因子，產(chǎn)生了一系列的分子靶向藥物，有的直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞上特異性受體，如索拉非尼、吉非替尼，有的則針對(duì)微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)因子，如貝伐單抗、西妥昔單抗、肝素等。 小分子多靶點(diǎn)激酶抑制劑索拉非尼可以阻

15、斷細(xì)胞生長(zhǎng)的重要通路Raf/MEK/ERK的多個(gè)酪氨酸激酶受體，并抑制VEGFR2、PDGFR、FLT3、Ret、和c-Kit等血管生成刺激因子。2007年2月12日，納入602例患者的III期臨床雙盲隨機(jī)對(duì)照研究SHARP試驗(yàn)顯示，與安慰劑相比，索拉非尼可顯著延長(zhǎng)晚期肝細(xì)胞癌或原發(fā)性肝癌患者的總生存期。 肝素/低分子量肝素通過(guò)與腫瘤微環(huán)境中生長(zhǎng)因子、阻滯因子、蛋白水解酶和基質(zhì)(ECM)蛋白結(jié)合，從而發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵

16、襲以及抑制血管生成的作用。腫瘤細(xì)胞分泌過(guò)量的類肝素酶降解ECM的重要組分硫酸類肝素蛋白聚糖，促成了腫瘤的播散和血管生成，肝素等類肝素酶抑制劑可以抑制這一作用。在一些臨床研究中發(fā)現(xiàn)，使用肝素或低分子量肝素對(duì)腫瘤患者有延長(zhǎng)生存期的作用。目前認(rèn)為這可能與直接抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤微環(huán)境中的各種蛋白和抗血管形成等因素有關(guān)。 一個(gè)主攻腫瘤細(xì)胞，一個(gè)阻抑腫瘤微環(huán)境蛋白，將這樣兩種抗腫瘤藥物聯(lián)用，理論上可以相互輔助，全面抑制腫瘤。我們

17、通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一假設(shè)，索拉非尼與肝素/達(dá)肝素聯(lián)用較單藥更有效地抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和血管增殖，在對(duì)黏附力和侵襲力等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)方面也表現(xiàn)出了一定的聯(lián)合作用，而在肝素、達(dá)肝素二者之間，無(wú)論單用或與索拉非尼聯(lián)用，效果差別均不顯著。我們可以在進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中明確兩藥聯(lián)用的整體水平效果及副作用，為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。同時(shí)，由于肝素/達(dá)肝素目前臨床上只是用于腫瘤患者的抗血栓治療，還未正式作為一種抗腫瘤藥物使用，嘗試將其與療效明確的抗腫瘤藥物