OK-432對膀胱腫瘤抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)排在所有惡性腫瘤的第九位。據(jù)報(bào)道，全球每年大約有330,000新發(fā)病例。膀胱癌的新發(fā)病例中70％為非肌層浸潤性膀胱癌（Non-Muscle-Invasive bladder cancer，NMIBC），目前在臨床上對于非肌層浸潤性膀胱癌的治療，經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（Transurethral Resection Of Bladder Tumor，TURBt）是

2、治療膀胱腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后再輔助其他的藥物進(jìn)行膀胱灌注治療。膀胱灌注治療是非肌層浸潤性膀胱癌治療的重要組成部分，對預(yù)防膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)展顯得尤為重要。因此，膀胱腫瘤術(shù)后灌注的藥物選擇就顯得非常關(guān)鍵。研究一種既可以預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)，而且對機(jī)體的副作用又小的藥物就顯得迫在眉睫。
　　OK-432為溶血性鏈球菌 A3或SIPI722低毒變異株經(jīng)青霉素滅活、冷凍干燥等過程處理得到的滅活菌體制劑。作為一種滅活的菌體，進(jìn)入體內(nèi)能誘發(fā)機(jī)體的免

3、疫功能，主要包括刺激巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞來而發(fā)揮抗腫瘤作用，但是其具體的作用機(jī)制還不是很明確。
　　本研究將OK-432與膀胱癌細(xì)胞系在體外共培養(yǎng)，了解OK-432對膀胱癌細(xì)胞系增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，以及應(yīng)用OK-432進(jìn)行大鼠膀胱灌注了解OK-432在體內(nèi)對膀胱腫瘤的作用，探討OK-432對膀胱癌的抑制作用及相關(guān)的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　1、將膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞與不同濃度O

4、K-432（0，0.125，0.25，0.5，1，2，4ke/ml，1ke OK-432相當(dāng)于100ug凍干的鏈球菌株）共培養(yǎng)24，48，72小時(shí)后，分別應(yīng)用MTS法檢測其OD值，來研究OK-432對T24和EJ細(xì)胞增殖的影響。
　　2、將不同濃度OK-432（0，0.1，0.5，1ke/ml）與T24和EJ細(xì)胞作用2周后，在倒置顯微鏡下觀察其對T24和EJ細(xì)胞克隆形成的影響。
　　3、將1，2，4ke/ml OK-432與

5、T24和EJ細(xì)胞作用24小時(shí)后，應(yīng)用EDU法檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞增殖的影響。
　　4、將1，2，4ke/ml OK-432與T24和EJ細(xì)胞作用24小時(shí)后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞凋亡的影響，并應(yīng)用western-blot檢測相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)情況。
　　5、將1，2，4ke/ml OK-432與T24和EJ細(xì)胞作用24小時(shí)后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞周期的影響，

6、并應(yīng)用western-blot檢測相關(guān)周期蛋白的表達(dá)情況。
　　6、將1，2，4ke/ml OK-432與T24和EJ細(xì)胞作用6時(shí)后，應(yīng)用Transwell檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞侵襲和遷移的影響，并應(yīng)用western-blot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　7、將1，2，4ke/ml OK-432與T24和EJ細(xì)胞作用24小時(shí)后，應(yīng)用western-blot檢測TLR4/NF-κb信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

7、r>　　8、應(yīng)用MNU把大鼠誘導(dǎo)形成膀胱腫瘤后，將OK-432進(jìn)行大鼠膀胱灌注，16周后處死大鼠并取出膀胱，進(jìn)行石蠟包埋、切片、免疫組化檢測。
　　結(jié)果：
　　1、MTS果發(fā)現(xiàn)，0.5，1，2，4ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞抑制作用明顯，且呈現(xiàn)濃度依賴性；克隆形成實(shí)驗(yàn)研究表明，0.1，0.5，1ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞的克隆形成有抑制作用，而且呈濃度依賴性的抑制；EDU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1，2，4

8、ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞的增殖有抑制作用，也呈濃度依賴性。
　　2、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，1，2，4ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞的促凋亡作用與正常對照組相比要顯著，且相關(guān)的凋亡蛋白 cleaved caspase3，cleaved caspase7，caspase9，Bax和cleaved PARP的蛋白表達(dá)量增加，Bcl-2的蛋白表達(dá)量減少。

9、>　　3、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞周期研究結(jié)果顯示，OK-432可以使T24和EJ細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0/G1，而且周期蛋白P15、P16的表達(dá)量下降，而Cyclin D1和Cyclin D3的表達(dá)量升高。
　　4、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1，2，4ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞的侵襲和遷移有明顯的抑制作用，且EMT相關(guān)的蛋白E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin，MMP9

10、，Snail，Vimentin的蛋白表達(dá)量下調(diào)。
　　5、Western-blot檢測TLR4/NF-κb信號(hào)通路研究結(jié)果顯示，OK-432作用于T24和EJ細(xì)胞后，TLR4的蛋白表達(dá)量上調(diào)，而p-NF-κb和p-IκBa表達(dá)上調(diào)。
　　6、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，MNU對大鼠進(jìn)行膀胱灌注8周后，大鼠膀胱腫瘤模型建立；后進(jìn)行OK-432膀胱灌注，16周后處死大鼠并取出膀胱組織行免疫組化檢查。結(jié)果顯示，MNU組PCNA的表達(dá)較OK-43

11、2組和正常對照組要高；TUNEL的結(jié)果顯示OK-432組細(xì)胞的凋亡陽性率比MNU組和正常對照組要高。
　　結(jié)論：
　　OK-432能夠抑制膀胱腫瘤細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡，而且能夠使T24和EJ細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0/G1；OK-432還能抑制T24和EJ細(xì)胞的侵襲和遷移；另外，研究發(fā)現(xiàn)OK-432可以通過TLR4/NF-κb抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡；而且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)OK-432能夠抑制腫