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文檔簡(jiǎn)介
1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)可引發(fā)豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),引起養(yǎng)豬業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失,是影響嚴(yán)重的病毒性傳染病之一。PRRSV的臨床特征為懷孕母豬繁殖障礙和仔豬呼吸紊亂,其感染的常見癥狀是長(zhǎng)程病毒血癥,缺乏天然免疫的誘導(dǎo)以及中和抗
2、體產(chǎn)生延遲,這是控制PRRSV的主要障礙。1987年該病于北美首次發(fā)現(xiàn),之后在世界范圍內(nèi)迅速傳播。1995年,我國(guó)暴發(fā)PRRS疫情,2006年我國(guó)南方豬場(chǎng)暴發(fā)高致死性豬傳染病,臨床特征為高熱、腹瀉和發(fā)紺,嚴(yán)重的導(dǎo)致死亡,后經(jīng)研究證實(shí)病原為高致病性PRRSV(Highly-pathogenic porcine reproductiveand respiratory syndrome virus, HP-PRRSV)。
TRIM5
3、α是一種限制性因子,能在病毒粒子核心進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后迅速阻斷逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。TRIM5α發(fā)揮限制活性是通過識(shí)別包裹病毒基因組RNA的衣殼蛋白,從而靶向病毒核心。TRIM5α由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:RING、B-box、Coiled-coil和PRYSPRY結(jié)構(gòu)域。作為E3泛素連接酶,TRIM5α能夠與異二聚體E2以及UBC13/UEV1A相互作用,從而激活TAK1激酶、NF-κB和AP-1信號(hào)傳導(dǎo)。但關(guān)于豬的TRIM5α(sTRIM5α)是否抑制
4、PRRSV的復(fù)制,以及PRRSV是否拮抗TRIM5α的抑制作用,國(guó)內(nèi)外還未有報(bào)道。
因此本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)上述問題開展。首先通過過表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)多種抗病毒分子能夠抑制PRRSV的復(fù)制,其中TRIM5α的作用很顯著,呈劑量依賴性;然后通過對(duì)比S-TRIM5α與人源TRIM5α,猴源TRIM5α的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)在幾種哺乳動(dòng)物中,TRIM5α的變異還是比較大的,所以后續(xù)的試驗(yàn)中選取了sTRIM5α作為研究對(duì)象;通過轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶等檢測(cè)
5、方法,發(fā)現(xiàn)sTRIM5α能激活A(yù)P-1天然免疫信號(hào)通路并呈劑量依賴性,而且激活A(yù)P-1信號(hào)通路的關(guān)鍵位點(diǎn)是RING結(jié)構(gòu)域第15和18位的半胱氨酸;最后通過轉(zhuǎn)染、co-IP等方法,發(fā)現(xiàn)S-TRIM5和TAK1之間能夠相互作用,且S-TRIM5能使TAK1泛素化。其次,通過轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶檢測(cè)等,發(fā)現(xiàn)PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白能拮抗sTRIM5α信號(hào)通路,其中非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structure protein,Nsp)Nsp1α和Nsp1β
6、的拮抗作用最顯著;然后通過轉(zhuǎn)染、Western blot等方法,發(fā)現(xiàn)Nsp1α和Nsp1β均能抑制sTRIM5α、TRAF6、TAK1和TAB2的表達(dá);最后通過轉(zhuǎn)染、Western-blot和點(diǎn)突變等方法,發(fā)現(xiàn)Nsp1α抑制TAK1的關(guān)鍵位點(diǎn)在ZF1區(qū)。因此我們得出如下結(jié)論:sTRIM5α能抑制PRRSV的復(fù)制,并能激活A(yù)P-1天然免疫信號(hào)通路;PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1α和Nsp1β能拮抗sTRIM5α對(duì)AP-1信號(hào)通路的激活;N
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