奧曲肽及其聯(lián)合順鉑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖抑制作用以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究奧曲肽（Octreotide，OCT）及其與順鉑（DDP）兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用在體外抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖作用的有效性，初步探討其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡誘導(dǎo)、形態(tài)改變及順鉑敏感性方面的影響及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用奧曲肽作為治療卵巢癌的一種輔助抗癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.以體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞SKOV3為研究對(duì)象，不同劑量的OCT、DDP及兩藥聯(lián)合作用于SKOV3細(xì)胞，采用四

2、甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法測(cè)定細(xì)胞光密度值（optical density，OD），計(jì)算生長(zhǎng)抑制率：a.順鉑、奧曲肽單藥對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響以及奧曲肽對(duì)人正常成纖維細(xì)胞株HF細(xì)胞增殖的影響；b.順鉑聯(lián)合奧曲肽對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響；c.奧曲肽對(duì)SKOV3細(xì)胞順鉑半數(shù)抑制濃度（IC50）的影響。
　　 2.細(xì)胞增殖生長(zhǎng)反應(yīng)及傳代實(shí)驗(yàn)。
　　 3.卵巢癌SKO

3、V3細(xì)胞。DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析。
　　 4.流式細(xì)胞儀分析奧曲肽、順鉑及兩藥聯(lián)合對(duì)SKOV3細(xì)胞周期分布的改變，及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 5.經(jīng)瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色后光學(xué)顯微鏡下觀察SKOV3細(xì)胞用藥前后的形態(tài)學(xué)改變。
　　 6.透射電鏡下觀察SKOV3細(xì)胞用藥前后的超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同濃度的奧曲肽和順鉑單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥可抑制SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且具有較明顯

4、的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系，抑制作用隨著藥物濃度的提高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中能夠觀測(cè)到各濃度OCT與DDP聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均比各相應(yīng)的單獨(dú)用藥組顯著增強(qiáng)，1～8ug/ml的奧曲肽可協(xié)同順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用，且隨著奧曲肽濃度的增大，其與順鉑的協(xié)同作用亦逐漸增強(qiáng)；奧曲肽、順鉑單藥的IC50分別為10.41 ug/ml和9.84ug/ml，4種不同濃度的奧曲肽（0.5

5、、1、4、8ug/ml）分別與順鉑聯(lián)用后順鉑的IC50明顯降低，與單用順鉑組比較，4種不同濃度的奧曲肽可使順鉑的IC50分別降低到7.48ug/ml、5.2ug/ml、3.64ug/ml、1.22ug/ml。
　　 2.光學(xué)顯微鏡下觀察正常SKOV3細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多邊形，細(xì)胞形態(tài)飽滿，呈叢簇狀排列，生長(zhǎng)旺盛；經(jīng)奧曲肽作用后，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，反差增大，胞質(zhì)粗糙，內(nèi)有顆粒物沉積，部分細(xì)胞脫壁死亡，以上變化隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸明顯。順

6、鉑與奧曲肽的作用相似。陰性對(duì)照細(xì)胞和HF細(xì)胞無(wú)任何變化，正常生長(zhǎng)。傳代實(shí)驗(yàn)表明，加入奧曲肽的HF細(xì)胞和未加藥的SKOV3細(xì)胞均可正常傳代，而加藥的SKOV3細(xì)胞則不能傳代。表明奧曲肽可明顯抑制SKOV3細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)反應(yīng)，且經(jīng)藥物作用后，細(xì)胞失去傳代能力，而對(duì)正常的HF細(xì)胞無(wú)影響。
　　 3.SKOV3細(xì)胞在4、8ug/ml的奧曲肽培養(yǎng)48h后進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中提取的DNA集中在加樣孔附近出現(xiàn)一條清晰的條帶，

7、為完整基因組DNA的表現(xiàn)。而4、8ug/ml的奧曲肽處理組中提取的DNA均在加樣孔后出現(xiàn)了典型的梯狀條帶，提示細(xì)胞DNA降解為有規(guī)律大小的片段。
　　 4.經(jīng)1、4ug/ml奧曲肽、5ug/ml順鉑及兩藥聯(lián)合作用48h后的SKOV3細(xì)胞，隨著奧曲肽濃度增加，S期細(xì)胞有增多趨勢(shì)，奧曲肽使細(xì)胞阻滯于S期；5ug/ml順鉑處理組出現(xiàn)G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多，使細(xì)胞阻滯于S期；兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，隨著奧曲肽濃度增加，出現(xiàn)較明顯的S期阻滯

8、，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度減少。且凋亡率也相應(yīng)增高，細(xì)胞凋亡百分率分別為1.4％±0.09％、15.5％±0.57％、6.27％±1.43％、11.64％±1.76％、36.61％±2.03％、45.76％±3.32％。
　　 5.經(jīng)瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色光學(xué)顯微鏡下觀察：對(duì)照組SKOV3細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多邊形，細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞質(zhì)豐富，胞核居于細(xì)胞中央，染色均勻，核仁清晰可見(jiàn)，生長(zhǎng)旺盛；而經(jīng)奧曲肽作用48h后，貼壁

9、的正常細(xì)胞減少，細(xì)胞皺縮呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)濃縮，核著色不均勻，嗜酸性增加，核染色質(zhì)濃集成紫藍(lán)色致密的球狀。
　　 6.透射電鏡下觀察SKOV3細(xì)胞的形態(tài)顯示：未經(jīng)處理的SKOV3細(xì)胞形態(tài)較大，呈梭形，胞膜完整，表面有大量絨毛樣突起。細(xì)胞核大，形態(tài)不規(guī)則，有1-3個(gè)核仁，內(nèi)染色質(zhì)豐富，無(wú)明顯染色質(zhì)邊集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體等細(xì)胞器；各實(shí)驗(yàn)組可呈現(xiàn)不同程度的凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征，尤以聯(lián)合組變化顯著。部

10、分SKOV3細(xì)胞明顯縮小，細(xì)胞表面微絨毛顯著減少甚至消失。胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)密度增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞器可辨認(rèn)，其數(shù)目減少。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃集成塊，電子密度增高，有的呈新月形或帽狀改變，邊集在核膜下。
　　 結(jié)論：
　　 1.奧曲肽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖具有明顯的抑制作用，呈時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)，而對(duì)SKOV3細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用劑量的奧曲肽對(duì)正常HF細(xì)胞無(wú)影響，可見(jiàn)奧曲肽應(yīng)用于卵巢癌的輔助治療具有可行性。