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文檔簡介
1、目的:研究奧曲肽(Octreotide,OCT)及其與順鉑(DDP)兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用在體外抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖作用的有效性,初步探討其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長抑制、凋亡誘導(dǎo)、形態(tài)改變及順鉑敏感性方面的影響及作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用奧曲肽作為治療卵巢癌的一種輔助抗癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論依據(jù)。
方法:
1.以體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞SKOV3為研究對(duì)象,不同劑量的OCT、DDP及兩藥聯(lián)合作用于SKOV3細(xì)胞,采用四
2、甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法測定細(xì)胞光密度值(optical density,OD),計(jì)算生長抑制率:a.順鉑、奧曲肽單藥對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響以及奧曲肽對(duì)人正常成纖維細(xì)胞株HF細(xì)胞增殖的影響;b.順鉑聯(lián)合奧曲肽對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響;c.奧曲肽對(duì)SKOV3細(xì)胞順鉑半數(shù)抑制濃度(IC50)的影響。
2.細(xì)胞增殖生長反應(yīng)及傳代實(shí)驗(yàn)。
3.卵巢癌SKO
3、V3細(xì)胞。DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析。
4.流式細(xì)胞儀分析奧曲肽、順鉑及兩藥聯(lián)合對(duì)SKOV3細(xì)胞周期分布的改變,及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
5.經(jīng)瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色后光學(xué)顯微鏡下觀察SKOV3細(xì)胞用藥前后的形態(tài)學(xué)改變。
6.透射電鏡下觀察SKOV3細(xì)胞用藥前后的超微結(jié)構(gòu)改變。
結(jié)果:
1.不同濃度的奧曲肽和順鉑單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥可抑制SKOV3細(xì)胞的生長,并且具有較明顯
4、的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系,抑制作用隨著藥物濃度的提高、作用時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時(shí)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中能夠觀測到各濃度OCT與DDP聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長抑制率均比各相應(yīng)的單獨(dú)用藥組顯著增強(qiáng),1~8ug/ml的奧曲肽可協(xié)同順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用,且隨著奧曲肽濃度的增大,其與順鉑的協(xié)同作用亦逐漸增強(qiáng);奧曲肽、順鉑單藥的IC50分別為10.41 ug/ml和9.84ug/ml,4種不同濃度的奧曲肽(0.5
5、、1、4、8ug/ml)分別與順鉑聯(lián)用后順鉑的IC50明顯降低,與單用順鉑組比較,4種不同濃度的奧曲肽可使順鉑的IC50分別降低到7.48ug/ml、5.2ug/ml、3.64ug/ml、1.22ug/ml。
2.光學(xué)顯微鏡下觀察正常SKOV3細(xì)胞呈長梭形或多邊形,細(xì)胞形態(tài)飽滿,呈叢簇狀排列,生長旺盛;經(jīng)奧曲肽作用后,細(xì)胞輪廓增強(qiáng),反差增大,胞質(zhì)粗糙,內(nèi)有顆粒物沉積,部分細(xì)胞脫壁死亡,以上變化隨作用時(shí)間的延長而逐漸明顯。順
6、鉑與奧曲肽的作用相似。陰性對(duì)照細(xì)胞和HF細(xì)胞無任何變化,正常生長。傳代實(shí)驗(yàn)表明,加入奧曲肽的HF細(xì)胞和未加藥的SKOV3細(xì)胞均可正常傳代,而加藥的SKOV3細(xì)胞則不能傳代。表明奧曲肽可明顯抑制SKOV3細(xì)胞的增殖生長反應(yīng),且經(jīng)藥物作用后,細(xì)胞失去傳代能力,而對(duì)正常的HF細(xì)胞無影響。
3.SKOV3細(xì)胞在4、8ug/ml的奧曲肽培養(yǎng)48h后進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn),對(duì)照組中提取的DNA集中在加樣孔附近出現(xiàn)一條清晰的條帶,
7、為完整基因組DNA的表現(xiàn)。而4、8ug/ml的奧曲肽處理組中提取的DNA均在加樣孔后出現(xiàn)了典型的梯狀條帶,提示細(xì)胞DNA降解為有規(guī)律大小的片段。
4.經(jīng)1、4ug/ml奧曲肽、5ug/ml順鉑及兩藥聯(lián)合作用48h后的SKOV3細(xì)胞,隨著奧曲肽濃度增加,S期細(xì)胞有增多趨勢,奧曲肽使細(xì)胞阻滯于S期;5ug/ml順鉑處理組出現(xiàn)G1期細(xì)胞減少,S期細(xì)胞增多,使細(xì)胞阻滯于S期;兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí),隨著奧曲肽濃度增加,出現(xiàn)較明顯的S期阻滯
8、,G0/G1期和G2/M期細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度減少。且凋亡率也相應(yīng)增高,細(xì)胞凋亡百分率分別為1.4%±0.09%、15.5%±0.57%、6.27%±1.43%、11.64%±1.76%、36.61%±2.03%、45.76%±3.32%。
5.經(jīng)瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色光學(xué)顯微鏡下觀察:對(duì)照組SKOV3細(xì)胞呈長梭形或多邊形,細(xì)胞形態(tài)飽滿,胞質(zhì)豐富,胞核居于細(xì)胞中央,染色均勻,核仁清晰可見,生長旺盛;而經(jīng)奧曲肽作用48h后,貼壁
9、的正常細(xì)胞減少,細(xì)胞皺縮呈圓形或卵圓形,胞質(zhì)濃縮,核著色不均勻,嗜酸性增加,核染色質(zhì)濃集成紫藍(lán)色致密的球狀。
6.透射電鏡下觀察SKOV3細(xì)胞的形態(tài)顯示:未經(jīng)處理的SKOV3細(xì)胞形態(tài)較大,呈梭形,胞膜完整,表面有大量絨毛樣突起。細(xì)胞核大,形態(tài)不規(guī)則,有1-3個(gè)核仁,內(nèi)染色質(zhì)豐富,無明顯染色質(zhì)邊集,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富,可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體等細(xì)胞器;各實(shí)驗(yàn)組可呈現(xiàn)不同程度的凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征,尤以聯(lián)合組變化顯著。部
10、分SKOV3細(xì)胞明顯縮小,細(xì)胞表面微絨毛顯著減少甚至消失。胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)密度增大,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞器可辨認(rèn),其數(shù)目減少。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃集成塊,電子密度增高,有的呈新月形或帽狀改變,邊集在核膜下。
結(jié)論:
1.奧曲肽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖具有明顯的抑制作用,呈時(shí)間-劑量依賴效應(yīng),而對(duì)SKOV3細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用劑量的奧曲肽對(duì)正常HF細(xì)胞無影響,可見奧曲肽應(yīng)用于卵巢癌的輔助治療具有可行性。
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