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4-HPR聯(lián)合DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、第一部分:4-HPR聯(lián)合DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞株增殖抑制作用的體外實(shí)驗(yàn)研究
   目的:4-羥苯基維胺脂(N-4-hydroxyphenylretinode,4-HPR)是一種全反式維甲酸的衍生物,實(shí)驗(yàn)研究和部分臨床實(shí)驗(yàn)表明,它對(duì)各種腫瘤有化學(xué)預(yù)防和治療雙重作用;順鉑(cis-platin,DDP)是卵巢癌常用的化療藥物,但因其毒副作用及其耐藥等問題,臨床應(yīng)用受到限制。本研究探討在體外環(huán)境下,4-羥苯基維胺酯(4-HPR)聯(lián)合順鉑(

2、DDP)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3增殖及凋亡的影響。
   方法:4-HPR單藥,DDP單藥及4-HPR+DDP聯(lián)合用藥方式多種劑量分別干預(yù)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3;MTT法檢測(cè)SKOV-細(xì)胞增殖抑制率變化;中效原理法判斷聯(lián)合用藥的相互作用;HOCHST和流式細(xì)胞單染和雙染分析凋亡細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   結(jié)果

3、:MTT檢測(cè)方法結(jié)果:
   1、兩種藥物單獨(dú)使用時(shí)均具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。
   2、DDP:藥物作用48小時(shí),各相鄰藥物濃度組之間,只有DDP20μM與DDP10μM濃度組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);藥物作用72小時(shí),從DDP2.5μM濃度組開始均與相鄰藥物濃度組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
   3、4-HPR:藥物作用48小時(shí),各相鄰藥物濃度組之間,只有4-HPR20μM與4-HPR10μM濃度組之間有

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;藥物作用72小時(shí),從4-HPR10μM至4-HPR20μM濃度組均與相鄰藥物濃度組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
   4、兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用后,根據(jù)中效濃度的計(jì)算,除4-HPR1μM+DDP5μM在48h的聯(lián)合應(yīng)用組外,在其余48h與72h的所有聯(lián)合應(yīng)用組,均CI<1,即兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生了協(xié)同作用的效果。
   HOECHST檢測(cè)方法:
   1)DDP與4-HPR在作用SKOV-3細(xì)胞株72h后,兩種藥物單

5、獨(dú)使用時(shí),均具有劑量依賴性。
   2)DDP與4-HPR的聯(lián)合應(yīng)用,根據(jù)中效濃度的計(jì)算,4-HPR5μM+DDP5μM組和4-HPR10μM+DDP5μM組均為CI<1,即兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生了協(xié)同作用的效果。
   流式雙染檢測(cè)法結(jié)果:
   1)DDP與4-HPR在作用SKOV-3細(xì)胞株72h后,兩種藥物單獨(dú)使用時(shí)均具有劑量依賴性。
   2)DDP與4-HPR的聯(lián)合應(yīng)用,根據(jù)中效濃度的計(jì)算,三組藥

6、物聯(lián)合應(yīng)用組均為CI<1,即兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生了協(xié)同作用的效果。
   流式單染檢測(cè)法:
   1)DDP與4-HPR聯(lián)合應(yīng)用組:DDP通過降低G1期細(xì)胞的比例,主要將細(xì)胞阻滯在G2期,抑制SKOV-3細(xì)胞的增殖,而4-HPR主要將細(xì)胞阻滯在S期和G2期。聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物的效果綜合了兩種藥物的單獨(dú)作用效果。
   結(jié)論:SKOV-3細(xì)胞在4-HPR5μM+DDP5μM和4-HPR10μM+DDP5μM聯(lián)合作用7

7、2h后,能夠產(chǎn)生明顯的抑制增殖的作用,且作用協(xié)同,其中4-HPR的使用濃度越高,抑制效應(yīng)越明顯。
   第二部分:4-HPR聯(lián)合DDP對(duì)卵巢癌移植瘤增殖抑制作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
   目的:建立人卵巢癌皮下移植瘤裸鼠模型,探討4-HPR和DDP單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)移植瘤的作用,進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。
   方法:先培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株SKVO-3,用細(xì)胞懸液接種法制備荷瘤鼠模型1只;再用套管針組織塊接種法進(jìn)行皮下接4

8、-HPR組種,共接種30只裸鼠;觀察成瘤情況;分組后腹腔分別給藥:(1)對(duì)照組:生理鹽水;(2)4-HPR組:8mg/kg;(3)順鉑組:3mg/kg;(4)聯(lián)合用藥組:4-HPR8mg/kg,4-HPR給藥6小時(shí)后給順鉑3mg/kg,均為腹腔注射給藥,一次注射劑量為0.2ml,每周兩次,共三周。每周測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、短徑,計(jì)算腫瘤體積,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線,取瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查;免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)瘤組織Caspase-3蛋白的表達(dá);檢測(cè)

9、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期變化。
   結(jié)果:用2.5×1010個(gè)/只細(xì)胞懸液接種成功制備荷瘤鼠一只,套管針皮下接種SKVO-3瘤塊后,2~3天皮丘消平,約4~5天可見微小的腫瘤結(jié)節(jié),接種成功率為100%。治療結(jié)束時(shí)測(cè)移植瘤體積分別為4937.72±563.28mm3、3726.34±462.32mm3、2687.78±631.91mm3、1532.69±723.84mm3,抑瘤率分別為0.00%、30.21%、42.78%、61.3

10、7%。移植瘤體積,各處理組均小于對(duì)照組,聯(lián)合用藥組小于單藥組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);腫瘤組織病理:剖視腫瘤,對(duì)照組大部分呈類圓形,有的腫瘤可見表面血管,顏色灰白,質(zhì)地較硬。光鏡下見,對(duì)照組腫瘤具有惡性腫瘤細(xì)胞的一般特性,還具有特征性的腺腔樣結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)組見不同程度點(diǎn)、片狀壞死,并有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),以聯(lián)合用藥組最重。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Caspase-3的變化,對(duì)照組、4-HPR組、順鉑組、聯(lián)合用藥組,結(jié)果用免疫組化評(píng)分(HIS

11、)分別為:2.78±1.33、4.15±0.76、5.22±0.62、6.37±1.25,各組與對(duì)照組相比,聯(lián)合用藥組與單藥組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:對(duì)照組、4-HPR組、順鉑組、聯(lián)合用藥組,細(xì)胞凋亡率逐漸升高,分別為6.43±2.31%、14.75±4.32%、21.54±1.47%、25.76±3.42%,細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞逐漸減少,G2/M期細(xì)胞逐漸增多,S期細(xì)胞變化不明顯。
  

12、 結(jié)論:4-HPR對(duì)SKVO-3細(xì)胞的增殖抑制作用呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系,4-HPR與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)順鉑對(duì)SKVO-3細(xì)胞的增殖抑制作用。4-HPR可抑制SKVO-3細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng),4-HPR與順鉑聯(lián)合應(yīng)用抑瘤效果增強(qiáng)。4-HPR可使SKVO-3細(xì)胞,細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,誘導(dǎo)其凋亡,4-HPR與順鉑聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)SKVO-3細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)。4-HPR可通過增加Caspase-3蛋白的表達(dá),增強(qiáng)SKVO-3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感

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