OCT4和SKOV3和SKOV3-DDP卵巢癌細胞中的表達差異分析.pdf

1、目的:卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中較常見的惡性腫瘤，其死亡率占所有婦科惡性腫瘤的首位，已經(jīng)嚴重威脅婦女的生命和身體健康，其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）來源于卵巢表層的生發(fā)上皮，是最多見的卵巢癌。卵巢癌的高死亡率主要是由于卵巢位于盆腔深部，其起病隱匿，缺乏早期的特異性癥狀和體征，絕大多數(shù)初診時已為晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)，患者多已經(jīng)表現(xiàn)為盆腹腔播散轉(zhuǎn)移，預后差。若卵巢癌初期被發(fā)現(xiàn)，其病變僅局限在卵巢包

2、膜內(nèi)（Ⅰ期），患者的5年生存率可達90％。目前，腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類和紫杉醇類為主的術(shù)后輔助化療是卵巢癌首選的治療方案。雖然約70％-80％卵巢癌患者對鉑類為主的初始化療有效，但耐藥率甚高，5年生存率僅為20％-30％。那么，何為卵巢癌耐藥的根源，何種細胞因子能抑制或促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展呢？這是學者們目前的研究熱點，但迄今為止仍未有突破性的進展。
　　近年來對干細胞的研究推動了腫瘤學的發(fā)展，因為腫瘤細胞的生長特點與干細胞有許多

3、相似之處，這就促成了“腫瘤干細胞(CSCs)”理論的提出?！澳[瘤干細胞”是指在腫瘤組織中所占比例非常少的一類具有干細胞特性的細胞，它具有無限增殖、自我更新和多向分化潛能。腫瘤干細胞最早在白血病中發(fā)現(xiàn)，隨后在乳腺癌、肺腺癌和前列腺癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞的存在。有學著認為它們可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展、復發(fā)和耐藥的關(guān)鍵。
　　腫瘤干細胞的干細胞特性使我們有理由相信調(diào)節(jié)正常干細胞生物學行為的信號因子也應(yīng)該可以作用于CSCs。OCT4、NA

4、NOG、KLF4以及SOX2是維持干細胞自我更新、無限增殖能力和多潛能性的主要信號分子，其中對OCT4的研究最多。信號分子Octamer4(OCT4)是POU轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，在胚胎干細胞、成人干細胞以及腫瘤干細胞中均呈高表達。Nature中一份研究表明OCT4的高表達可以維持胚胎干細胞的自我更新、無限增殖和多向分化潛能。小干擾RNA(siRNA)抑制OCT4的表達可誘導腫瘤干細胞凋亡并顯著抑制腫瘤的生長。發(fā)表在Cancer的一篇

5、文章研究顯示OCT4在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株中呈高表達，并且OCT4在低分化子宮內(nèi)膜癌組織中的表達高于高分化癌組織，其與腫瘤的分級呈負相關(guān)。由此我們設(shè)想耐藥的上皮性卵巢癌可能與OCT4的高表達有關(guān)。
　　本實驗通過體外培養(yǎng)非耐藥人卵巢漿液性囊腺癌細胞系SKOV3，耐順鉑細胞系SKOV3/DDP，同時建立兩種細胞株裸鼠皮下移植瘤模型，旨在研究OCT4在耐藥和非耐藥卵巢癌細胞株及移植瘤中的表達情況，探討OCT4與上皮性卵巢癌

6、耐藥的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng):人卵巢漿液性囊腺癌細胞系SKOV3和耐藥細胞系SKOV3/DDP用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并放置于37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中。
　　2.體內(nèi)移植瘤模型建立:常規(guī)體外培養(yǎng)非耐藥人卵巢漿液性囊腺癌細胞系SKOV3，耐藥細胞系SKOV3/DDP，待細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底80％-90％時收集細胞，對細胞進行計數(shù)，制成5×107個/ml單細胞懸液，分別以每

7、只裸鼠0.2ml（即1×107個細胞）于無菌條件下接種于裸鼠背側(cè)近后肢處的皮下。測量移植瘤的大小，在最長徑達0.5-0.8cm（10天左右）時將腫瘤取出，部分立即放入液氮，后續(xù)實驗備用，部分制成單細胞懸液，以備流式細胞檢測。
　　3.流式細胞技術(shù):應(yīng)用流式細胞技術(shù)分別檢測細胞水平和移植瘤組織中OCT4蛋白的表達水平。
　　4.實時定量PCR技術(shù):取出未經(jīng)試劑固定、保存于液氮罐中的移植瘤組織，用RT-qPCR技術(shù)檢測移植瘤組織

8、和癌細胞株中mRNA-OCT4的表達情況。
　　5.統(tǒng)計學方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以兩個獨立樣本均數(shù)比較的t檢驗分析，結(jié)果以(x)±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.在體外培養(yǎng)中，與非耐藥SKOV3細胞株相比，耐藥SKOV3/DDP細胞中OCT4在mRNA和蛋白質(zhì)水平均表現(xiàn)為高表達，應(yīng)用流式細胞分析結(jié)果顯示:與ISO type同型對照相比，OCT4陽

9、性表達細胞高達92.8％，而非耐藥SKOV3細胞株流式分析陽性表達率僅為52.9％，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2.在體內(nèi)裸鼠移植瘤模型中，耐藥SKOV3/DDP移植瘤流式細胞分析中OCT4陽性細胞為3.7％，而非耐藥SKOV3移植瘤中OCT4陽性率為2.5％。同時應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測兩種裸鼠移植瘤中mRNA-OCT4的表達情況，發(fā)現(xiàn)耐藥SKOV3/DDP移植瘤中mRNA-OCT4的表達量高于非耐藥SKOV3移植瘤