靶向Livin的microRNA干擾對人卵巢癌細胞SKOV3體外作用的研究.pdf

1、目的:研究靶向Livin的microRNA干擾對人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細胞SKOV3的體外作用。構(gòu)建兩個microRNA干擾序列連接到質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細胞,檢測轉(zhuǎn)染前后Livin mRNA的表達變化以及細胞增殖、凋亡和周期的改變。探討針對凋亡抑制基因Livin的靶向治療對卵巢癌逆轉(zhuǎn)的可行性,為卵巢癌靶向性治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.體外復(fù)蘇、培養(yǎng)并連續(xù)傳代人卵巢漿液

2、性乳頭狀腺癌SKOV3細胞,并于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。
　　 2.設(shè)計合成特異性靶向Livin基因的microRNA序列,并連接到質(zhì)粒載體,該載體表達綠色熒光。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的SKOV3細胞。分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和熒光細胞數(shù),以判斷轉(zhuǎn)染的效率。
　　 3.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染前后Livin mRNA表達水平的變化。
　　 4.采用四甲基

3、偶氮唑藍(MTT)比色法檢測microRNA干擾對SKOV3細胞體外生長的增殖抑制作用。
　　 5.采用流式細胞術(shù)(FCM)檢測microRNA干擾對SKOV3細胞周期分布及凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.光鏡與熒光顯微鏡顯示:靶向Livin的microRNA轉(zhuǎn)染后24h,對照組培養(yǎng)基清亮,細胞生長密集,光澤度好;轉(zhuǎn)染組細胞密度較對照組低,光澤度下降,熒光顯微鏡下可見部分細胞呈現(xiàn)綠色熒光。轉(zhuǎn)染后48h,對照

4、組細胞已有重疊生長,轉(zhuǎn)染組細胞貼壁率下降,貼壁細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光,熒光細胞數(shù)占細胞總數(shù)70％-80％,證明轉(zhuǎn)染成功。
　　 2.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測結(jié)果顯示:靶向Livin的microRNA轉(zhuǎn)染后48h,對照組、陰性轉(zhuǎn)染組、實驗轉(zhuǎn)染組的Livin mRNA兩個亞基條帶與內(nèi)參條帶灰度值比。Livinα在對照組和陰性轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為0.58±0.21％、0.53±0.06％,在實驗轉(zhuǎn)染組為0.36

5、±0.06％,實驗轉(zhuǎn)染組灰度比值明顯小于對照組和陰性轉(zhuǎn)染組,組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。Livinβ在對照組和陰性轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為0.75±0.10％、0.73±0.15％,在實驗轉(zhuǎn)染組為0.48±0.20％,實驗轉(zhuǎn)染組灰度比值明顯小于對照組和陰性轉(zhuǎn)染組,組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。以上結(jié)果顯示Livin mRNA的α與β兩個亞基在轉(zhuǎn)染后SKOV3細胞中的表達水平明顯減弱。表明靶向Livin基因的microRNA

6、干擾對于人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細胞具有可行性。
　　 3.四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測結(jié)果顯示:以陰性轉(zhuǎn)染組、實驗轉(zhuǎn)染組與對照組的抑制率相比較,靶向Livin的microRNA轉(zhuǎn)染后24h,陰性轉(zhuǎn)染組細胞的生長抑制率為2.44±0.78％,而實驗轉(zhuǎn)染組為30.37±2.17％,組間比較差異有顯著性(P＜0.05);轉(zhuǎn)染后48h,陰性轉(zhuǎn)染組抑制率為2.54±0.30％,實驗轉(zhuǎn)染組為46.49±3.36％,組間比較差

7、異有顯著性(P＜0.05);轉(zhuǎn)染后72h,陰性轉(zhuǎn)染組細胞生長抑制率為3.33±0.20％,實驗轉(zhuǎn)染組為55.26±2.69％,組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染后24h到72h細胞抑制率呈增高趨勢,說明microRNA干擾對SKOV3細胞生長抑制率的影響呈一定的時間依賴性。
　　 4.流式細胞術(shù)(FCM)結(jié)果顯示:靶向Livin的microRNA轉(zhuǎn)染后48h,對照組無明顯凋亡峰出現(xiàn),各轉(zhuǎn)染組在細胞周期G1期前出現(xiàn)了亞二倍

8、體凋亡峰且S期細胞比例下降,G0/G1期細胞比例上升,凋亡率增高。對照組及陰性轉(zhuǎn)染組細胞凋亡指數(shù)分別為1.26±0.19％、5.57±0.21％,實驗轉(zhuǎn)染組為17.44±1.41％,實驗轉(zhuǎn)染組細胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組及陰性轉(zhuǎn)染組,組間比較差異有顯著性(P＜0.05);對照組及陰性轉(zhuǎn)染組細胞增殖指數(shù)分別為76.97±2.80％、69.20±2.26％,實驗轉(zhuǎn)染組為53.47±2.51％,實驗轉(zhuǎn)染組細胞增殖指數(shù)明顯低于對照組及陰性轉(zhuǎn)染組,

9、組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。表明microRNA干擾對SKOV3細胞增殖具有明顯抑制作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.設(shè)計并合成了靶向Livin的microRNA序列,經(jīng)質(zhì)粒連接、脂質(zhì)體介導(dǎo)可成功轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細胞。
　　 2.靶向Livin的microRNA干擾能下調(diào)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細胞中Livin mRNA的表達。從而為microRNA在RNAi及基因

10、靶向治療的可行性方面提供了實驗依據(jù)。
　　 3.靶向Livin的microRNA干擾對人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細胞的體外增殖具有明顯抑制作用,且具有一定的時間依賴性。
　　 4.靶向Livin的microRNA干擾能將人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細胞周期阻滯于G0/G1期,影響腫瘤細胞DNA的合成;并造成細胞周期G1期前明顯的亞二倍體凋亡峰的出現(xiàn),說明其在抑制卵巢癌細胞增殖的同時尚能誘導(dǎo)細胞凋亡。