靶向NOB1反義寡核苷酸對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3影響的體外研究.pdf

1、目的:
　　通過觀察NOB1反義寡核苷酸(NOB1-ASODN)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3內(nèi)NOB1基因及其mRNA表達(dá)的影響,和其對(duì)SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖、細(xì)胞的凋亡及侵襲力的作用,初步探討NOB1基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用。為進(jìn)一步研究其在卵巢癌及其他腫瘤在其發(fā)生、發(fā)展的過程中分子調(diào)節(jié)機(jī)制;同時(shí)為尋找腫瘤靶基因治療的研究提供新的線索和參考依據(jù)。
　　方法:
　　1、設(shè)計(jì)合成針對(duì)NOB1mRNA的特定NOB1

2、-ASODNs序列以及作為對(duì)照的無義寡核苷酸片段NOB1-NSODNs,應(yīng)用轉(zhuǎn)染載體X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent將NOB1-ASODNs及NOB1-NSODNs轉(zhuǎn)染至人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、無義鏈(NOB1-NSODN)對(duì)照組及(NOB1-ASODN)處理組,在倒置熒光相差顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后24h不同濃度(0.75μg/ml、1.5μg/ml、3.0μg

3、/ml)的NOB1-ASODN后各組細(xì)胞形態(tài)的變化,同時(shí)連續(xù)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)7天,取其均值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖,選擇對(duì)細(xì)胞影響最大的濃度進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。
　　2、采用RT-PCR方法從核酸水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞NOB1 mRNA的表達(dá)情況。
　　3、MTT法檢測(cè)在3.0μg/ml濃度的反義核苷酸轉(zhuǎn)染后不同作用時(shí)間段(24h、48h、72h)下對(duì)各組SKOV3細(xì)胞的體外增殖抑制效應(yīng)。
　　4、采用Hoechst33258染色法在

4、倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后48h各組SKOV3細(xì)胞凋亡形態(tài)。
　　5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分析轉(zhuǎn)染24h不同處理組SKOV3細(xì)胞的早期凋亡率。
　　6、利用Transwell小室法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h后個(gè)處理組SKOV3細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:
　　1、觀察到NOB1-ASODN能成功轉(zhuǎn)染入SKOV3細(xì)胞,經(jīng)過不同濃度組的NOB1-ASODN作用后的細(xì)胞,細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)明顯改變:邊緣不整齊、欠光滑、細(xì)胞間隙可見較多

5、散在的細(xì)胞細(xì)胞碎片,同時(shí)伴隨凋亡小體形成,其中以3.0μg/ml濃度組的作用最明顯,三個(gè)對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)無明顯改變,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好;同時(shí)所繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖顯示,最高濃度組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效果最明顯,與對(duì)照組比較,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),選取3.0μg/ml的轉(zhuǎn)染濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、RT-PCR結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染后48h,NOB1-ASODN能有效下調(diào)NOB1mRNA的表達(dá)水平,且NOB1 mRNA的抑制率達(dá)59

6、.58％,與其余3個(gè)對(duì)照組相比,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),NOB1-NSODN對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組以及空白對(duì)照組之間的差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3、NOB1反義寡核苷酸對(duì)SKOV3細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用,且具有一定的時(shí)間依賴性,細(xì)胞抑制率在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h分別平均達(dá)到:37.02%、56.16%、58.10%;與對(duì)照組相比,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),3個(gè)對(duì)照組之間細(xì)胞受抑制情況的差

7、異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4、在熒光顯微鏡下觀察,經(jīng)過NOB1-ASODN作用48h后的SKOV3細(xì)胞出現(xiàn)體積變小、呈不規(guī)則狀態(tài)、胞核出現(xiàn)染色質(zhì)聚集,同時(shí)可見核碎解,表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的形態(tài)。而轉(zhuǎn)染NOB1-NSODN組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、空白對(duì)照組的細(xì)胞其細(xì)胞核呈現(xiàn)均質(zhì)淡染的藍(lán)色熒光,核呈圓形或橢圓形、比較規(guī)則飽滿。
　　5、經(jīng)NOB1-ASODN作用后,SKOV3的細(xì)胞凋亡率明顯升高,與NOB1-NSODN對(duì)照

8、組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組以及空白對(duì)照組之間對(duì)比,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),各個(gè)對(duì)照組之間細(xì)胞凋亡率相比較,差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);
　　6、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,NOB1-ASODN處理組平均每高倍視野下細(xì)胞穿膜數(shù)目明顯減少,同對(duì)照組相比,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),余3個(gè)對(duì)照組之間細(xì)胞穿膜數(shù)目的差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、NOB1-ASODN可成