骨橋蛋白影響卵巢癌細胞SKOV3侵襲轉(zhuǎn)移潛能的實驗研究.pdf

1、目的: 檢測卵巢癌細胞株SKOV3中骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和其他轉(zhuǎn)移相關(guān)基因尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase plasminogen activator，uPA）和乙酰肝素酶（heparanase，HPA）的表達，研究OPN對卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響并初步探討其可能機制。 材料與方法: 卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3細胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)于含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，

2、用0.25％的胰酶消化傳代。用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1（-）/OPN，同時轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（-）作為對照，并利用G418篩選獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR檢測OPN mRNA表達水平，Touching凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，并與β-actin相比較計算結(jié)果以分析OPN表達強度。用Western-blot檢測OPN蛋白表達，用DAB顯色盒顯示蛋白條帶。采用T

3、ouching凝膠成像系統(tǒng)軟件測定Western-blot條帶凈灰度值，并與內(nèi)參結(jié)果比較，計算其比值。以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，在4℃、12000r/min的條件下，離心5min，分取各組細胞上清液用ELISA測定OPN、uPA及HPA的表達，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）。并采用基質(zhì)凝膠侵襲實驗檢測兩組細胞侵襲力，甲醇固定，伊紅染色，以侵襲細胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。實驗結(jié)果率的比較采用x2檢驗，兩樣本間均數(shù)

4、比較行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1、RT-PCR結(jié)果示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OPN的相對表達量（1.268±0.046）明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（0.550±0.027），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。Western-blot檢測OPN蛋白表達，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OPN的蛋白表達（0.642±0.079）較空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組高（0.371±0.033），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 2、ELISA法

5、檢測細胞培養(yǎng)上清液，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OPN為（3.605±0.205）ng/ml，空白質(zhì)粒對照組為（1.602±0.119）ng/ml，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組uPA為（5.342±0.031）ng/ml，空白質(zhì)粒對照組為（1.956±0.047）ng/ml，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HPA為（2.762±0.145）ng/ml，空白質(zhì)粒對照組為（2.692±0.140）ng/ml，兩

6、組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 3、基質(zhì)凝膠侵襲實驗重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞透膜細胞數(shù)為（36.459±4.447），空白質(zhì)粒對照組細胞透膜細胞數(shù)為（18.128±6.017），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論: 1、OPN對卵巢癌細胞的侵襲潛能有促進作用。 2、OPN可能通過上調(diào)uPA的表達以促進卵巢癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。 3、可為進一步探尋以O(shè)PN為靶點的卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療和進一步的實驗