HE4蛋白對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，死亡率居首位。卵巢癌發(fā)病隱匿，早期無(wú)明顯癥狀，又缺乏有效的篩查手段，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期。多年來(lái)卵巢癌5年生存率一直徘徊在30％以下[1]，如果卵巢癌能夠早期發(fā)現(xiàn)并治療，其5年生存率可以提高到70～90％[1,2]。因此，為尋求有效的早期診斷和治療方案，卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制一直是婦科腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究探索的重點(diǎn)。
　　人附睪蛋白4(human epididymis protein4，HE4)是一種小分

2、子分泌型糖蛋白，從1991年發(fā)現(xiàn)至今，大量的臨床流行病學(xué)研究證實(shí)HE4對(duì)卵巢癌的早期診斷、療效檢測(cè)和預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值，其敏感度和特異性優(yōu)于經(jīng)典的卵巢癌標(biāo)記物CA125[3-5]。然而，作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物，其表達(dá)增加的意義及機(jī)制還不清楚。目前有關(guān)HE4基因和蛋白功能的研究正在成為熱點(diǎn)。LeBleu VS等[6]以腎纖維化轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，首次證實(shí)了HE4具有蛋白酶抑制劑的功能，拓展了人們對(duì)HE4功能的認(rèn)識(shí)。然而對(duì)于HE4參與卵巢

3、癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究很少。本課題組利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了HE4基因的原核表達(dá)載體，成功表達(dá)并獲得了較高純度的重組HE4蛋白。為今后檢測(cè)HE4的互作蛋白、受體蛋白奠定基礎(chǔ)。我們同時(shí)購(gòu)買了真核表達(dá)的重組HE4蛋白進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。我們以卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV-3作為模式細(xì)胞，將HE4蛋白作用于細(xì)胞，結(jié)果顯示，經(jīng)HE4蛋白處理后，SKOV-3細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為明顯增強(qiáng)，如細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中意外發(fā)現(xiàn)，

4、HE4蛋白處理后，SKOV-3細(xì)胞對(duì)化療藥卡鉑的耐藥性增強(qiáng)。通過(guò)檢測(cè)凋亡因子Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平，我們推斷，HE4對(duì)細(xì)胞耐藥行為的影響可能是通過(guò)調(diào)控Bcl-2家族成員的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。我們進(jìn)一步利用基因芯片技術(shù)篩選HE4處理前后SKOV3細(xì)胞的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)HE4蛋白的應(yīng)答基因涉及廣泛的功能，包括周期調(diào)節(jié)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖，凋亡，DNA修復(fù)，應(yīng)激反應(yīng)等。本研究有助于全面了解細(xì)胞對(duì)HE4蛋白的應(yīng)答機(jī)制，以期為卵巢癌特

5、殊生物學(xué)行為和耐藥機(jī)制研究提供新的思路。
　　全文分下列兩部分:
　　第一部分重組HE4蛋白的原核表達(dá)和純化
　　目的:
　　重組及表達(dá)HE4融合蛋白。
　　方法:
　　以合成pcDNA3.1-HE4質(zhì)粒為模板，用帶NcoⅡ/NotⅠ雙酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物HE4片段與pET28a載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5a菌中進(jìn)行克隆并測(cè)序鑒定。進(jìn)一步構(gòu)建pET28a-HE4表達(dá)體系，用異丙基β-D-硫代

6、半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，在BL21菌中表達(dá)HE4融合蛋白(含有His-Tag)。蛋白經(jīng)Ni2+-NTA層析柱純化后，進(jìn)行SDS-PAGE分析鑒定。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建了HE4融合蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　2、在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了HE4重組蛋白的可溶性高表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　采用原核表達(dá)方法可獲得較高純度的HE4融合蛋白，為進(jìn)一步研究HE4的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分 HE4蛋白對(duì)人

7、卵巢癌細(xì)胞系SKOV3生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制研究
　　目的:
　　HE4作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)廣泛應(yīng)用在卵巢癌的診斷中。本實(shí)驗(yàn)擬探討其對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3的生物學(xué)表型的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　檢測(cè)重組HE4蛋白處理后， SKOV3細(xì)胞增殖、周期分布和凋亡細(xì)胞比例的變化，并通過(guò)基因芯片技術(shù)探討HE4處理前后卵巢癌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1、重組HE4蛋白刺激后