奧曲肽聯(lián)合順鉑對人卵巢癌細胞SKOV3的增殖抑制及其對VEGF與P-gp表達的影響.pdf

1、目的：卵巢上皮性腫瘤是最常見的卵巢腫瘤，其惡性類型占卵巢惡性腫瘤的85％～95％，而卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，死亡率居婦科腫瘤的首位。傳統(tǒng)的三大治療方法雖有一定進步，但因臨床癥狀隱匿，早期診斷困難，晚期病人療效不佳。目前卵巢癌的治療仍難以令人滿意。研究表明血管生成是實體腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必備條件，而且與腹水生成有關(guān)。腫瘸和宿主組織均可產(chǎn)生多種血管生成因子，他們相互作用參與腫瘤血管形成的各個階段。血管內(nèi)皮生長因子（vascular end

2、othelial growth factor，VEGF）是一種主要的血管生成因子，VEGF與其受體結(jié)合后，通過一系列信號轉(zhuǎn)導途徑促進腫瘤血管形成。目前，化療仍是除手術(shù)治療之外的重要治療手段之一。研究發(fā)現(xiàn)，導致腫瘤化療失敗的原因之一是腫瘤對化療藥物的多藥耐藥。多藥耐藥是指由一種藥物誘發(fā)，對該藥耐藥的同時，對其結(jié)構(gòu)和作用機制無關(guān)的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥。P-gp（P-glycoprotein）是多藥耐藥基因1（multidrug resist

3、ance gene1，MDR1）編碼的一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，具有ATP酶活性，能將化療藥物從細胞內(nèi)泵出，降低細胞內(nèi)的有效藥物濃度而致多藥耐藥。本文研究奧曲肽（octreotide，OCT）與順鉑單用及合用對體外培養(yǎng)的SKOV3卵巢癌細胞生長的影響及檢測VEGF與P-gp的表達，初步揭示其在血管方面的作用機制及耐藥性研究。探討奧曲肽用于卵巢癌臨床治療的可行性。
　　 方法：
　　 1.人卵巢癌細胞SKOV3的培養(yǎng)、傳代以及生長

4、曲線的測定。
　　 2.體外培養(yǎng)人卵巢癌細胞SKOV3，采用四甲基偶氮唑藍（tetrzolium-based colorimetric assay，MTT）比色法檢測奧曲肽對該細胞增殖的抑制作用。
　　 3.MTT比色法檢測奧曲肽與順鉑聯(lián)合應(yīng)用后對SKOV3細胞的抗增殖作用，采用金氏公式[1]分析相互作用指數(shù)（Interaction Index），評價兩藥聯(lián)合應(yīng)用后的作用，如相互作用指數(shù)>0.85表示相加作用，相互作用指

5、數(shù)<0.85為拮抗作用。
　　 4.倒置顯微鏡和H-E染色法觀察細胞的形態(tài)學變化。
　　 5.應(yīng)用免疫細胞化學方法檢測VEGF、P-gp的表達。
　　 6.奧曲肽對人卵巢癌細胞SKOV3侵襲的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.在無藥物干預下，SKOV3細胞生長迅速，加入奧曲肽后細胞生長相對減慢，且隨奧曲肽濃度增大，細胞生長曲線更趨低平。
　　 2.MTT比色法表明，奧曲肽能抑制人卵巢癌細胞S

6、KOV3的體外生長，不同濃度的奧曲肽（0.1、0.5、1、5、10μg/ml）對SKOV3細胞的增殖均可產(chǎn)生抑制作用，且隨濃度的增加，抑制作用逐漸增強，而且隨著奧曲肽作用時間的延長，抑制作用也逐漸增強，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。即奧曲肽對SKOV3細胞增殖的抑制作用在一定的濃度范圍內(nèi)呈明顯的時間-劑量依賴關(guān)系。
　　 3.將奧曲肽與順鉑聯(lián)合后發(fā)現(xiàn)對SKOV3細胞的增殖有明顯的抑制作用，均大于奧曲肽或順鉑單

7、用的效果。本文采用0.5、1、5μg/ml的奧曲肽與1.25、2.5、5μg/ml的順鉑聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)隨著奧曲肽濃度的增大，其與順鉑的相加作用亦逐漸增強。金氏公式分析相互作用指數(shù)表明，0.5、1、5μg/ml的奧曲肽聯(lián)合不同濃度的順鉑其相互作用指數(shù)均>0.85，說明兩藥臺用后，其療效具有相加的作用。
　　 4.倒置顯微鏡下觀察對照組SKOV3細胞貼壁生長良好，呈長梭形或菱形，透明，形態(tài)飽滿，細胞增生活躍；而經(jīng)奧曲肽作用48小時后

8、的部分細胞不貼壁，皺縮，破裂，呈不規(guī)則形。經(jīng)H-E染色后觀察，對照組SKOV3細胞還可見細胞核染色均勻，而經(jīng)藥物作用后，SKOV3細胞出現(xiàn)形態(tài)變圓，體積縮小，胞質(zhì)濃縮等現(xiàn)象。
　　 5.免疫細胞化學結(jié)果顯示，VEGF蛋白主要定位于細胞漿，呈棕黃色。對照組中，VEGF蛋白在SKOV3細胞漿中呈強表達；經(jīng)藥物處理48小時后，VEGF蛋白的染色明顯減弱（P<0.05）。P-gp蛋白定位于胞漿與胞膜，呈棕褐色顆粒，在未用藥的SKOV3細

9、胞的細胞膜和胞漿中也呈陽性表達，經(jīng)各濃度奧曲肽處理后，表達均減弱，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 6.奧曲肽對人卵巢癌細胞SKOV3侵襲的影響，對照組穿膜細胞數(shù)為146個/400倍視野，經(jīng)作用24小時后，濃度分別為5μg/ml和10μg/ml的奧曲肽的穿膜細胞數(shù)分別為82個/400倍視野和35個/400倍視野。
　　 結(jié)論：
　　 1.奧曲肽對體外培養(yǎng)的人卵巢癌細胞SKOV3的生長有抑制

10、作用，為卵巢癌的臨床治療提供了一種新的手段。
　　 2.奧曲肽抑制SKOV3細胞增殖的作用在一定的濃度范圍內(nèi)呈明顯的時間-劑量依賴關(guān)系。
　　 3.奧曲肽和順鉑聯(lián)合應(yīng)用對人卵巢癌細胞SKOV3的抑制作用增強，強于兩者的單獨應(yīng)用，具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 4.奧曲肽能使SKOV3細胞中VEGF蛋白表達下調(diào)，說明其抗腫瘤作用可能與其抑制腫瘤血管的形成有關(guān)。
　　 5.奧曲肽能下調(diào)SKOV3細胞中P-gp蛋白的表達