醛縮酶B在索拉非尼治療肝癌的耐藥作用研究.pdf

1、研究目的:原發(fā)性肝細胞癌（以下簡稱，肝癌）是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率極高。其主要原因之一是肝癌病人門靜脈癌栓(以下簡稱PVTT)發(fā)生率很高，50％-60％的肝癌病人首診時通過影像學檢查就會發(fā)現(xiàn)有門靜脈癌栓。PVTT可導致肝癌病人門靜脈壓力升高、肝功能惡化、肝癌細胞肝內(nèi)轉移擴散等。因此研究肝癌伴門靜脈癌栓發(fā)生的防治策略及早期診斷是臨床提高肝癌病人整體療效的當務之急。
　　晚期肝癌的治療中索拉非尼是當今世界公認的

2、最為有效的藥物，巴塞羅那分期中明確指出中晚期(BCLC∶C)患者推薦使用索拉非尼。但隨著索拉非尼的臨床應用卻發(fā)現(xiàn)許多臨床耐藥的現(xiàn)象。引起臨床耐藥的原因有很多，既往以腫瘤干細胞、基因突變等角度解釋其耐藥機制，但仍有很多局限。任何基因或狀態(tài)的改變最終都會反映在代謝產(chǎn)物上。因而代謝組學是繼蛋白組學與轉錄組學之后一門新興學科，是組學的最終方向。也逐漸成為了腫瘤耐藥研究的熱點。
　　因此，將通過代謝組學技術揭示肝癌代謝重構規(guī)律，尋找引起代謝

3、重構的關鍵基因，進而研究目的基因與索拉非尼敏感性關系，為臨床用藥提供指導。
　　研究方法:
　　1、通過對臨床配對肝癌相關的（非癌-原位癌-癌栓）組織原代培養(yǎng)，并利用13C穩(wěn)定同位素示蹤實驗技術觀察配對組織中代謝流量變化，揭示肝癌PVTT的發(fā)生發(fā)展中代謝重構特點。
　　2、對比臨床配對肝癌相關的（非癌-原位癌-癌栓）組織的基因芯片篩選代謝相關基因，并通過Western blot蛋白免疫印跡和免疫組化實驗驗證。確定目的基

4、因為ALDOB。
　　3、構建pGFP-ALDOB嘌呤霉素抗性質粒通過慢病毒包裝轉染Huh-7、MHCC-LM3及CSQT-2肝癌細胞，并通過抗性篩選得到穩(wěn)轉細胞系。
　　4、以過表達ALDOB的肝癌細胞系為基礎，通過13C穩(wěn)定同位素示蹤實驗技術觀察ALDOB及Sorafenib對代謝重構的影響。
　　5、以過表達ALDOB的肝癌細胞系為基礎，利用CCK8實驗研究ALDOB及Sorafenib對增殖能力;應用Trans

5、well遷移、侵襲實驗研究ALDOB及Sorafenib對肝癌細胞的侵襲轉移能力等生物學功能的影響。
　　6、購買部分免疫缺陷裸鼠，構建裸鼠皮下荷瘤模型觀察ALDOB及Sorafenib對荷瘤能力;構建裸鼠尾靜脈肺轉移模型觀察ALDOB及Sorafenib對轉移能力等體內(nèi)的生物學影響。
　　7、收集臨床術后服用Sorafenib的肝癌患者組織標本，應用免疫組化技術觀察ALDOB的表達情況。
　　8、回顧性分析ALDOB

6、的表達對服用Sorafenib肝癌患者的預后影響。
　　結果:
　　1、臨床配對肝癌相關的（非癌-原位癌-癌栓）組織的代謝重構特點，結合臨床配對肝癌相關的（非癌-原位癌-癌栓）組織的基因芯片篩選及臨床配對肝癌組織樣本驗證，發(fā)現(xiàn)在肝癌的發(fā)生發(fā)展（非癌-原位癌-癌栓）過程中ALDOB逐漸下降。
　　2、ALDOB過表達及應用Sorafenib對肝癌細胞的代謝水平發(fā)生了明顯的變化，提示:ALDOB是肝癌發(fā)生發(fā)展中調(diào)節(jié)糖代謝重

7、構的關鍵基因。ALDOB對Sorafenib用藥前后代謝改變趨勢相反。
　　3、ALDOB過表達可抑制肝癌細胞的增殖。在此基礎上應用Sorafenib，下降了藥物對腫瘤的抑制效果。提示;ALDOB是肝癌發(fā)生發(fā)展中的關鍵基因。ALDOB下降了Sorafenib對腫瘤細胞的抑制作用。
　　4、ALDOB抑制了Sorafenib對腫瘤細胞線粒體膜電位的下調(diào)。
　　5、ALDOB減少了Sorafenib對腫瘤細胞產(chǎn)生ROS的抑