抑制肺鱗癌細(xì)胞FANCM和USP1基因?qū)樸K的增敏效應(yīng).pdf

1、目的：DNA損傷修復(fù)是腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物耐藥的重要機(jī)制，F(xiàn)A/BRCA通路在鉑類藥物所致細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究通過抑制人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1株FA/BRCA通路上游蛋白FANCM和去泛素化蛋白USP1，觀察FA/BRCA通路激活狀態(tài)，探討這些干預(yù)對(duì)化療藥物順鉑（DDP）敏感性的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書介紹的程序?qū)⑻禺愋葬槍?duì) FANCM和 USP1

2、基因的siRNA（ FANCM-siRNA和USP1-siRNA）分別和共轉(zhuǎn)染于SK-MES-1細(xì)胞株。采用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）測(cè)定轉(zhuǎn)染后FANCM和USP1蛋白表達(dá)以驗(yàn)證siRNA轉(zhuǎn)染效率確保轉(zhuǎn)染成功；Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染前后SK-MES-1細(xì)胞經(jīng)10μg/ml DDP處理24h后的早期凋亡率變化； CCK-8（Cell Counting Kit-8）法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞經(jīng)10μg/ml DDP

3、處理24h和48h后的生存率；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞經(jīng)不同濃度梯度DDP處理后FANCD2蛋白單泛素化水平，以及免疫熒光染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞核內(nèi)FANCD2核聚小體的表達(dá)狀態(tài)。
　　結(jié)果：（1）SK-MES-1細(xì)胞分別經(jīng)FANCM-siRNA和USP1-siRNA轉(zhuǎn)染后，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，F(xiàn)ANCM蛋白和USP1蛋白表達(dá)均明顯降低(兩者均P<0.05)，表明FANCM-siRNA轉(zhuǎn)染和USP1-siRNA轉(zhuǎn)染皆有

4、效；（2）肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1分別轉(zhuǎn)染和雙轉(zhuǎn)染FANCM-siRNA和USP1-siRNA后，用10μg/ml DDP處理24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞的早期凋亡率明顯高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。但轉(zhuǎn)染USP1-siRNA的細(xì)胞早期凋亡率高于轉(zhuǎn)染FANCM-siRNA的細(xì)胞。USP1-siRNA和FANCM-siRNA雙轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞早期凋亡率明顯高于單轉(zhuǎn)染FANCM-siRNA細(xì)胞的早期凋亡率(P<0.05)，而與單轉(zhuǎn)染USP1-siR

5、NA細(xì)胞的早期凋亡率比較無明顯差異（P>0.05）。（3）肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1分別轉(zhuǎn)染和雙轉(zhuǎn)染FANCM-siRNA和USP1-siRNA后，用10μg/ml DDP分別處理24h和48h，細(xì)胞生存率和半數(shù)抑制率（IC50）明顯下降，與未轉(zhuǎn)染組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染USP1-siRNA細(xì)胞的生存率低于轉(zhuǎn)染FANCM-siRNA的細(xì)胞（P<0.05）。USP1-siRNA和FANCM-siRNA雙轉(zhuǎn)染后經(jīng)DDP處理

6、24h和48h的細(xì)胞生存率和IC50明顯低于單轉(zhuǎn)染FANCM-siRNA細(xì)胞生存率(P<0.05)，而與單轉(zhuǎn)染USP1-siRNA細(xì)胞生存率比較無明顯差異（P>0.05）。（4）肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞經(jīng)FANCM-siRNA轉(zhuǎn)染并經(jīng)DDP處理后，以FANCD2-L/S比值所表示的FANCD2單泛素化水平下調(diào)，同時(shí)胞核內(nèi)的FANCD2核聚小體表達(dá)降低，提示FA/BRCA通路上游基因FANCM沉默導(dǎo)致FANCD2單泛素化受抑制。轉(zhuǎn)染US

7、P1-siRNA后，DDP誘導(dǎo)的FANCD2單泛素化水平上調(diào)，核內(nèi)FANCD2核聚小體表達(dá)增強(qiáng)，提示FANCD2去泛素化酶USP1被抑制后，造成單泛素化的FANCD2堆積。此外，雙轉(zhuǎn)染FANCM-siRNA和USP1-siRNA后，DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞FANCD2單泛素化水平明顯高于單轉(zhuǎn)染FANCM-siRNA的細(xì)胞，但低于單轉(zhuǎn)染USP1-siRNA的細(xì)胞，胞核內(nèi)FANCD2核聚小體表達(dá)無明顯改變，這一結(jié)果的機(jī)制如上所述。
　　結(jié)論：

8、沉默F(xiàn)ANCM基因后通過抑制FA/BRCA通路FANCD2蛋白單泛素化，使得FA/BRCA通路下游蛋白不能被激活，從而無法對(duì)DDP誘導(dǎo)的DNA損傷實(shí)施修復(fù)；沉默USP1基因后可使FANCD2去泛素化受抑制，導(dǎo)致已泛素化的FANCD2在細(xì)胞內(nèi)堆積，亦不能激活FA/BRCA通路下游蛋白。兩者都可阻斷FA/BRCA通路，抑制DNA損傷修復(fù)，導(dǎo)致SK-MES-1細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性增高，值得注意的是沉默USP1基因后對(duì)DDP的增敏效應(yīng)更為明顯。