龍葵堿增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑和X射線敏感性及其機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的首要原因。其中，肺腺癌作為肺癌的一種重要亞型，其發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。肺腺癌的放化療敏感性普遍較差，盡管近年來(lái)其治療取得了一些進(jìn)展，但并沒(méi)有明顯改善患者的生存率。因此探尋新的治療方法，以及提高傳統(tǒng)放化療的治療效果就成為一個(gè)重要的課題。
　　近年來(lái)，小分子抗腫瘤化合物的在腫瘤防治中的作用受到廣泛的關(guān)注。例如楊梅黃酮，生物堿苷類(lèi)物質(zhì)等，這些小分子化合物能夠通過(guò)多樣化的

2、機(jī)制影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，或改變腫瘤細(xì)胞的放化療敏感性，為腫瘤的治療提供了新的思路與方法。龍葵堿（又名α-茄堿，α-solanine）是一種具有生物活性的甾體配糖生物堿，常見(jiàn)于馬鈴薯塊莖和其它茄屬植物中?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)龍葵堿能夠通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，因此有必要從抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞放化療敏感性的影響等多個(gè)方面對(duì)其抗腫瘤作用進(jìn)行研究。
　　腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療等均受到復(fù)雜的分子機(jī)制的調(diào)控和影響。其中miRNA

3、是一類(lèi)非編碼的小RNA分子，通常具有18-24個(gè)堿基大小，能夠通過(guò)與mRNA特定位點(diǎn)的作用來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，例如調(diào)控腫瘤的遷移和侵襲，影響腫瘤的放療、化療敏感性等。近年來(lái)有研究指出龍葵堿能夠通過(guò) miRNAs作用于下游一些功能性的靶基因，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力以及放化療敏感性等。
　　本研究將分兩部分對(duì)龍葵堿在肺腺癌中的抗腫瘤作用進(jìn)行探索：第一部分，龍葵堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力和細(xì)胞

4、對(duì)順鉑和X射線敏感性的影響；第二部分，龍葵堿增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑和X射線的敏感性的機(jī)制探索。
　　第一部分龍葵堿增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑和X射線的敏感性
　　方法:
　　1.運(yùn)用MTT方法測(cè)定龍葵堿對(duì)兩種肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
　　2. Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)龍葵堿對(duì) A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)肺腺癌侵

5、襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2，MMP-9和TIMP-1的表達(dá)。
　　3.運(yùn)用MTT方法，通過(guò)檢測(cè)龍葵堿和順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，評(píng)價(jià)龍葵堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響。
　　4.利用克隆形成實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)龍葵堿與X射線聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，評(píng)價(jià)龍葵堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞X射線敏感性的影響。
　　5.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)龍葵堿作用后，移植瘤對(duì)順鉑和X射線的敏感性的變化。收集移植瘤標(biāo)本，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量R

6、T-PCR及Western blot檢測(cè)瘤體內(nèi)放化療增敏相關(guān)基因PDCD4，PTEN，Cdk2，F(xiàn)AK的表達(dá)情況。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：對(duì)得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)間的比較，單因素方差分析進(jìn)行多組數(shù)據(jù)間的比較；對(duì)于計(jì)量資料，應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)；以α=0.05為顯著性水準(zhǔn)。
　　結(jié)果
　　1.MTT結(jié)果顯示15μmol/L龍葵堿對(duì)A549和H1299細(xì)胞均有明顯的

7、細(xì)胞毒性（P<0.05），而低濃度的龍葵堿對(duì)A549和H1299細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。2.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低濃度的龍葵堿（3μmol/L，6μmol/L）能抑制A549和H1299細(xì)胞的遷移和侵襲能力。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示低濃度龍葵堿能夠引起腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)下降，而TIMP-1的表達(dá)增加（P<0.05）。
　　3. MTT檢測(cè)及克隆形成實(shí)驗(yàn)提示低濃

8、度龍葵堿能夠增強(qiáng)順鉑和放射線對(duì)A549和H1299細(xì)胞的抑制作用。
　　4.荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)顯示龍葵堿能在體內(nèi)試驗(yàn)水平增強(qiáng)移植瘤組織對(duì)順鉑和X射線的敏感性（P<0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blot對(duì)幾種常見(jiàn)的放化療增敏相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果顯示龍葵堿能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)FAK的表達(dá)（P<0.05）。
　　第二部分龍葵堿增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑和X射線敏感性的機(jī)制研究
　　方法:
　　1.應(yīng)用實(shí)時(shí)

9、熒光定量RT-PCR檢測(cè)3μmol/L和6μmol/L龍葵堿在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549和H1299細(xì)胞中FAK基因mRNA表達(dá)的影響，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中FAK蛋白的表達(dá)。
　　2.應(yīng)用TargetScan及 miRanda等生物信息學(xué)軟件分析調(diào)控 FAK基因的上游miRNA。
　　3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)3μmol/L和6μmol/L龍葵堿對(duì)A549和H1299細(xì)胞中miR-138表達(dá)水平

10、的影響。
　　4.運(yùn)用Pearson相關(guān)性分析分析細(xì)胞中miR-138和FAK mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　5.應(yīng)用Overlap PCR方法擴(kuò)增突變型FAK3’UTR片段，并應(yīng)用PCR擴(kuò)增野生型FAK3’ UTR片段，構(gòu)建野生型及突變型FAK3’ UTR的重組雙熒光素酶報(bào)告基因載體，分別與合成的miR-138 mimics或者miR-138 scramble共轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)FAK為mi

11、R-138的靶基因。
　　6.使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將合成的miR-138 mimics或者miR-138 scramble分別轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H1299細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照組。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組A549和H1299細(xì)胞中miR-138的表達(dá)情況。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組A549和H1299細(xì)胞的遷移和侵襲能力的變化。MTT法檢測(cè)不同濃度順鉑對(duì)各組細(xì)胞增殖能力

12、的抑制作用，評(píng)價(jià)上調(diào)miR-138的表達(dá)對(duì)細(xì)胞順鉑敏感性的影響。克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同劑量射線對(duì)各組細(xì)胞增殖能力的抑制作用，評(píng)價(jià)上調(diào)miR-138的表達(dá)對(duì)細(xì)胞放療敏感性的影響。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞放化療敏感性相關(guān)基因FAK的表達(dá)變化。
　　7.構(gòu)建無(wú)3’UTR區(qū)的FAK表達(dá)載體，與miR-138 mimics共轉(zhuǎn)染或者單獨(dú)轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，設(shè)立空白對(duì)照組以及3μmol/L龍葵堿作用組，

13、應(yīng)用Restore實(shí)驗(yàn)分析miR-138靶向調(diào)控FAK表達(dá)的作用機(jī)制。
　　8.合成靶向FAK基因的特異性siRNA，采用MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)分析比較siRNA-FAK、龍葵堿和miR-138對(duì)順鉑和X射線作用于A549細(xì)胞的敏感性的變化。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS22.0軟件對(duì)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　　1.低濃度龍葵堿抑制肺腺癌細(xì)胞株A549和H1299細(xì)胞中FAK mRNA和蛋

14、白的表達(dá)水平。
　　2.生物信息學(xué)軟件分析以及進(jìn)一步的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-138靶向作用于FAK基因。
　　3.低濃度龍葵堿誘導(dǎo)A549和H1299細(xì)胞中miR-138的表達(dá)。
　　4.Pearson相關(guān)性分析提示miR-138和FAK mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　5. Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較Scramble組和Blank組，miR-138組A549和H1299細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯下

15、降（P<0.05）。
　　6. MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Scramble組和Blank組相比，miR-138組順鉑和射線的LC50明顯降低，A549和H1299細(xì)胞對(duì)順鉑和X射線的敏感性明顯增加（P<0.05）。
　　7.Western blot結(jié)果表明，相對(duì)于Scramble組和Blank組，miR-138組細(xì)胞FAK表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。
　　8.Restore實(shí)驗(yàn)顯示，無(wú)3’ UTR區(qū)的F

16、AK的表達(dá)不受miR-138的調(diào)控，并且其作用可以覆蓋上調(diào)miR-138表達(dá)后對(duì)A549細(xì)胞順鉑和X射線的增敏作用。
　　9.向A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-FAK，過(guò)表達(dá)miR-138，以及加入3μmol/L龍葵堿，其作用無(wú)顯著差異，進(jìn)一步提示了龍葵堿可上調(diào)細(xì)胞中miR-138的表達(dá)，而miR-138進(jìn)一步作用于FAK的3’ UTR區(qū)，負(fù)向調(diào)控FAK蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑和X射線的敏感性。
　　結(jié)論：